Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.
Agrobacterium sp. is één van de meest gebruikte methoden voor het verkrijgen van transgene planten als het heeft de mogelijkheid om te dragen en de plant genoom te integreren in de eigen T-DNA. Hier presenteren we twee transformatie systemen om genetisch wijzigen aardappelplanten (Solanum tuberosum). In A. tumefaciens transformatie, bladeren zijn besmet, getransformeerde cellen worden geselecteerd en een nieuwe volledige getransformeerde fabriek wordt geregenereerd fytohormonen met 18 weken. In A. rhizogenes transformatie, stengels zijn besmet door het injecteren van de bacteriën met een naald, de nieuwe getransformeerd naar voren gekomen harige wortels worden gedetecteerd met behulp van een rode fluorescerende markering en de wortels niet-getransformeerd worden verwijderd. In 5-6 weken is de resulterende plant een composiet van een wild type shoot met volledig ontwikkelde getransformeerde harige wortels. Het vergroten van de biomassa, kunnen de getransformeerde harige wortels worden weggesneden en zelf doorgegeven. We beide Agrobacterium –gemedieerde transformatie methoden om te verkrijgen van de wortels die de GUS verslaggever-gen uitdrukt gedreven door een promotor van suberine biosynthetic gene toegepast. De GUS kleuring procedure wordt verstrekt en laat de lokalisatie van de cel van de inductie van de promotor. In beide methoden toonde de getransformeerde aardappel wortels vlekken in de suberized endodermis en exodermis, en bovendien, in de A. rhizogenes getransformeerd wortels de activiteit GUS GUS is ook aangetroffen in de opkomst van laterale wortels. Deze resultaten suggereren dat A. rhizogenes een snel alternatief instrument te bestuderen van de genen die worden uitgedrukt in wortels kan zijn.
Afgezien van economisch belang heeft de generatie van transgene planten zijn eigen belang in onderzoek om aan te tonen de ultieme functie van genen en plantenfysiologie en ontwikkeling beter te begrijpen. De meest gebruikte methode voor plant DNA invoeging Agrobacterium is-gemedieerde transformatie. Agrobacterium tumefaciens vermag kroon kurkachtig genereren in de geïnfecteerde weefsel van vele plantensoorten door de inwerking van de tumor-inducerende (Ti) plasmide. Het plasmide bevat een T-DNA-regio met een aantal genen die zullen worden geïntegreerd in het genoom van de plant en het veroorzaken van weefsel dedifferentiation1,2. De uitwisseling van deze genen binnen de T-DNA door de transgenic heeft de generatie van specifieke plant wijzigingen vermijden van fenotypische effecten3toegestaan. Om te vergemakkelijken de transgenic klonen in de T-DNA, heeft de regio van T-DNA is weggesneden in een onafhankelijke plasmide genoemd een binaire plasmide, terwijl de rest van de genen van de Ti-plasmide (de virulentiegenen waarmee de mechanismen voor overdracht en inbrengen van T-DNA) geweest Geplaatst in een plasmide helper. Voor plant biotechnologisch onderzoek, transformatie door A. tumefaciens heeft verschillende voordelen: het heeft geen behoefte aan dure apparaten, is in staat om zowel stabiel en voorbijgaande plant transformatie, als lage aantallen van gen exemplaren zijn geïntegreerd in de chromosoom4. De generatie van stabiele transformants vereist echter voor de meeste planten, maar niet, Arabidopsis plant regeneratie van één of een paar cellen met behulp van exogene fytohormonen, waardoor dit proces moeizaam en tijdrovend. A. rhizogenes is ook kundig voor wijzigen van het genoom van de plant, produceren harige wortels of bijwortels op de sites van de infectie als gevolg van de expressie van genen van de rol (wortel loci) gecodeerd in de root-inducerende (Ri) plasmide5. Hoewel minder dan A. tumefaciensstudeerde, wordt A. rhizogenes ook gebruikt voor het verkrijgen van transgene wortels. In dit geval, bevat de A. rhizogenes het oorspronkelijke T-DNA in het plasmide Ri en een binaire plasmide met een tweede T-DNA die de transgenic. Wanneer de infectie-site in stengels of hypocotyls is, kan een samengestelde plant worden verkregen, met nieuwe harige transgene wortels opkomende van wild type schiet. Als alternatief, harige getransformeerde wortels kunnen groeien autonoom in vitro in media met koolstof bronaanvoeren. Het gebruik van A. rhizogenes in plaats van A. tumefaciens voor de productie van transgene weefsel wint relevantie als de hoofdmap de doel-orgel, is vanwege de regeneratie van de plant is niet vereist en vandaar het is sneller en minder kostbaar. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze methode uitgetrokken voor de fenotypische karakterisering van wortel specifieke genen6,7,8,9.
De aardappel (Solanum tuberosum) is de vierde belangrijkste gewas in de wereld volgens de voedsel- en Landbouworganisatie van de Verenigde Naties (FAO), omdat de Knol voeding relevantie voor menselijke consumptie voor het zijn een goede bron van vitaminen en mineralen. Om die reden, aardappel in de schijnwerpers van landbouwkundige biotechnologie is gezet en ook wordt beschouwd als een goede biologische model voor genetische en ontwikkelingsbiologie10,11 bestudeert. Aardappel transformatie in belangrijke mate bijgedragen aan het begrip van de moleculaire mechanismen onderliggende suberized weefsels via de karakterisatie van genen betrokken bij suberine en wax biosynthese12,13,14 ,15,16,17, suberine monomeer vervoer18 en transcriptie verordening19. Het suberine feruloyl transferase gen, FHT, behoort tot deze gekarakteriseerd biosynthetic genen; haar Downregulatie geeft aanleiding tot een sterke aantasting van de bescherming van de periderm, die is gecorreleerd met een sterke afname van de ferulate esters van suberine en wassen in aardappel knollen14. Gelijktijdig, in de wortels en zaden van Arabidopsis, de knock-out van haar vermeende orthologue (ASFT/RWP1) ook blijk gegeven van haar rol in het produceren van alkyl ferulates in suberine20,21. In aardappel toonde de FHT transcriptionele verslaggever lijn en het antilichaam FHT respectievelijk dat de promotor-activiteit en het eiwit zich in de exodermis, de endodermis, de phellogen-derivaten en gewonde weefsels15 bevinden.
In dit werk detailleren wij een protocol met behulp van A. rhizogenes voor de productie van transgene harige wortels die worden bijgehouden in een wild type shoot, het genereren van samengestelde aardappelplanten of weggesneden om te groeien autonoom in vitro. We bieden ook het protocol dat A. tumefaciens gebruikt om volledige transgene aardappelplanten. Als een case-studie, worden A. rhizogenes en A. tumefaciens getransformeerd met de dezelfde binaire vector gebruikt voor het verkrijgen van de wortels met de promotor van de FHT GUS verslaggever genexpressie rijden. De resultaten worden gerapporteerd en vergeleken.
In aardappel, het meest voorkomende systeem voor stabiele volledige transgene planten gebruikt de transformatie door Agrobacterium tumefaciens stammen waarvoor organogenese gebruik van exogene fytohormonen. Hoewel de Agrobacterium gebaseerde protocollen heeft het potentieel om het integreren van niet-T-DNA vector reeks25, is deze methode nog het makkelijkst en minder dure beschikbaar voor transformeren aardappelplanten. Tijdens de laatste jaren de belangstelling voor A. rhizo…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI subsidie voor PB), Ministerio de Economía y Competitividad en FEDER financiering (AGL2012-36725, AGL2015 + 67495 + C2 + 1-R) en de Universiteit van Girona (PhD grant SF en subsidie SING11/1). De auteurs zijn Dr. Inge Broer (Instituut voor ruimtelijke ordening, Universiteit van Rostock, Rostock, Duitsland) en Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanje) dankbaar voor het verstrekken van de A. rhizogenes en de A. tumefaciens stam, respectievelijk, en Dr. Marçal Soler en Dr. Anna Plasencia voor de hulp en steun ontvangen in het initiëren van de experimenten van de transformatie A. rhizogenes (Universiteit Paul Sabatier van Toulouse III — CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Castanet-Tolosan, Frankrijk). De auteurs bedanken Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) voor haar waardevolle hulp in het laboratoriumwerk uitvoeren en het verzorgen van planten, en Ferran Fontdecaba en Carla Sánchez die bijgestaan met een aantal van de experimenten terwijl ze aan het doen waren hun projecten van de laatste graad.
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
Microscope |
Olympus |
||
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
pHmetre |
Crison |
||
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
Vacuum |
Dinko |
||
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |