Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing
Summary
Un protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.
Abstract
VIH sigue siendo incurable debido a la existencia de un reservorio de células que alberga de forma estable y latente del virus, que permanece invisible al sistema inmune y no está dirigido por la actual terapia antirretroviral (carro). Transcripción y splicing han demostrado reforzar la latencia del VIH-1 en la reclinación de las células T CD4 +. Revocación de la latencia por el uso de agentes de reversión de latencia (LRAs) en el enfoque de “choque y muerte” se ha estudiado extensivamente en un intento de purgar este embalse pero hasta ahora no ha mostrado éxito en ensayos clínicos debido a la falta de desarrollo de pequeños adecuada moléculas que eficientemente pueden perturbar este embalse. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente evaluación de agentes de reversión de latencia (LRAs) sobre la transcripción del VIH y empalme. Este enfoque se basa en el uso de un reportero de color dual basada en litros que puede medir simultáneamente el efecto de un LRA en transcripción y splicing mediante citometría de flujo. El protocolo descrito aquí es adecuado para células adherentes, así como las células en suspensión. Es útil para probar un gran número de medicamentos en un sistema de alto rendimiento. El método es técnicamente rentable y fácil de implementar. Además, el uso de citometría de flujo permite la evaluación de la viabilidad celular y así la toxicidad de la droga al mismo tiempo.
Introduction
A pesar de terapia antirretroviral a largo plazo eficaz, el VIH persiste en estado latente como un provirus integrado en la memoria de las células T CD4 +1. La estructura de la cromatina de los VIH-1 5′ promotor de repetición terminal larga (LTR) y modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y desacetilación de ADN metiltransferasas (DNMT) e histona deacetilasas (HDAC) son mecanismos importantes que conducen a represión transcripcional y post integración latencia2,3. Una gran variedad de agentes de inversión de latencia (LRAs) ha sido investigada por su eficacia inducir la producción de virus in vitro y en vivo de latente infectados descanso CD4 + T células4,5,6,7 ,8. Entre las LRAs probado, HDACi (inhibidores de la HDAC) y apuesta bromodominios inhibidores (BETis) inducen la decondensation de la cromatina y la liberación de la transcripción positivo alargamiento factor b (P-TEFb) respectivamente, dando lugar a posteriores aliviar de la transcripcional represión en el LTR 5′ y la activación del VIH expresión9,10,11,12,13. Sin embargo, la magnitud de reactivación alcanzada por estos LRAs fue limitada como sólo un modesto aumento en células asociadas unspliced VIH mRNA (RNA), indicativo de la transcripción viral, observó ex vivo14,15. Importante, estos LRAs también no pudieron inducir una reducción en la frecuencia de las células infectadas latente.
Expresión de VIH puede ser más restringido por empalme ineficiente16 así como defectos en la exportación nuclear de multiplicar empalmado HIV RNA (RNA MS)17. Así, se necesitan identificables nuevas clases de LRAs que son más potentes y pueden afectar distintos aspectos de la integración después de la producción de virus. Además, se requiere el desarrollo de nuevos ensayos que ayudan a definir los compuestos óptimos para invertir eficientemente latencia.
Aquí, se presenta un protocolo, que utiliza un enfoque de alto rendimiento para la evaluación funcional del impacto de intervenciones basadas en LTR del VIH transcripción y splicing. En Resumen, un nuevo dual basada en LTR color reportero sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figura 1) se utiliza para evaluar reactivación de VIH mediante citometría de flujo. En este reportero fluorescente, la expresión de mRNA de VIH unspliced (4 kb) conduce a la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), mientras que la expresión de mRNA empalmado (2 kb) daría lugar a la expresión de la proteína fluorescente Discosoma SP rojo (DsRed). Brevemente, hemos utilizado una proteína fluorescente de fusión Env-EGFP, gp140unc. EGFP, donde la secuencia de codificación de EGFP fue colocada en el marco de forma truncada y no hendida de la envoltura (Env). Cambios fueron introducidos para ablar del sitio de la hendidura evitando la disociación de la Env gp120 y gp41-EGFP y truncar la proteína gp160 antes el dominio de la transmembrana creando un análogo soluble de la Env, que facilita el plegamiento correcto y expresión de EGFP. A la expresión dentro de una célula, Rev se localiza en el núcleo donde interviene en la exportación nuclear-citoplásmico de la env de 4 kb mRNA mediante la interacción con el elemento de respuesta rev (RRE). El truncamiento de la Env no comprometiera RRE, que se encuentra entre gp120 y gp41 y el A7 3′ sitio del empalme. En este sistema, que empalma en el VIH-1 empalme donante 4 (SD4) y el empalme aceptador 7 (SA7) resultados en la producción de 2 kb mRNA que codifican una proteína Rev no funcional truncada en el aminoácido 38 unida a proteína fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed fue insertado en el exón 2nd de Rev en el aminoácido 38 por superposición extensión18. Para facilitar la exportación nuclear de mRNA unspliced, un vector de expresión mamífero codificación Rev (pCMV-RevNL4.3) fue co transfectado con el constructo de reportero fluorescente (figura 2). Esta construcción única reportera aquí descrita es útil en la evaluación de alto rendimiento de la transcripción del VIH y empalme, sin necesidad de usar vectores virales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dada la dificultad en la medición de la reactivación del virus ex vivo, una amplia gama de vitro se desarrollaron modelos sobre el tiempo para estudiar la latencia del VIH incluyendo latente infectados líneas de células T (J-Lats, ACH2, U1), modelos primarios de la infección latente de descanso) Modelos o ‘ Doherty, Lewin, Greene y espina) o pre-activado de células T CD4 + (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, modelos de Karn) sola ronda o replicación competente reportero virus22. Para model…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto APP1129320 y la beca del programa APP1052979 de la NHMRC de Australia. Agradecemos al Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson y Michelle Y. Lee para proporcionar asesoramiento y construcciones esenciales para la realización de este trabajo. También agradecemos al personal del establecimiento de flujo DMI para su asesoramiento y asistencia generosa para mantener el citómetro de flujo utilizado en este estudio.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure – The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
- Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
- Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
- Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
- Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
- Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
- Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
- Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
- Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
- Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
- Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
- Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
- Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
- Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
- Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
- Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
- Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
- Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
- Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
- Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
- Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
- Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
- Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
- Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
- Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
- Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
- Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
- Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
- Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
- Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency – reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
- Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).
