대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량
Summary
에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.
Abstract
HIV에 안정적이 고 잠재적인 바이러스, 면역 체계에 보이지 않는 유지 하 고 현재 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 의해 타겟이 되지 형태의 항구 셀의 저수지의 존재 때문에 불 치이 남아 있다. 전사 및 접합 CD4 + T 세포 휴식에서 HIV-1 대기 시간을 강화 하기 위해 표시 되었습니다. 대기 시간 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) “충격 및 죽이기” 접근의 사용에 의해의 반전이이 저수지를 제거 하기 위해에서 광범위 하 게 공부 하고있다 하지만 있다 지금까지 표시 되지 않습니다의 적절 한 개발의 부족으로 인해 임상 시험에 있는 성공 분자가이 저수지를 교란 효율적으로 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에는 안정적이 고 효율적으로 HIV 전사에 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) 평가 및 접합 방법을 제공 한다. 이 방법은 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 동시에 전사 및 접합에 아이라의 효과 측정할 수 있는의 사용 cytometry에 의해을 기반으로 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 부착 셀에에서 셀에 대 한 적절 한입니다. 그것은 높은 처리량의 시스템에서 약물의 많은 수를 테스트 하기 위한 유용 합니다. 메서드는 기술적으로 구현 하는 간단 하 고 비용 효율적인. 또한, cytometry 사용 세포 생존 능력의 평가 허용 하 고 따라서 동시에 독성 약물.
Introduction
효과적인 장기 투여 요법에도 불구 하 고 HIV 메모리 CD4 + T 세포1에 통합된 provirus로 숨겨진 상태로 유지 됩니다. 에이즈-1 5의 염색 질 구조 ‘ 긴 단말기 반복 (LTR) 발기인 및 히스톤 메 틸 화 등 DNA methyltransferases (DNMT) 및 히스톤 deacetylases (HDAC) deacetylation 후 성적인 수정은에 지도 하는 중요 한 메커니즘 transcriptional 억제 하며 따라서 사후 통합 대기 시간2,3 대기 시간 역전 에이전트 (LRAs)의 큰 다양 한 생체 외에서 바이러스 생산을 유도 하기 위해 그들의 효 험에 대 한 조사 및에서 vivo에서 latently 감염 휴식 CD4 + T 세포4,,56,7 ,8. LRAs 중 테스트, HDACi (HDAC 저 해제)와 내기 bromodomain 억제제 (베티스) 유도 chromatin decondensation 및 긍정적인 녹음 방송 신장 요인 b (P-TEFb)의 출시 각각,는 transcriptional의 완화 후속으로 이어지는 5′ LTR 억압 고 에이즈 식9,10,11,,1213의 활성화. 그러나 Ex vivo14,15셀 관련 unspliced HIV mRNA (미국 RNA), 바이러스 성 전사의 지표에 겸손 한 증가 관찰 했다, 이러한 LRAs 여 재 활성화의 크기 제한 되었다. 중요 한 것은, 이러한 LRAs latently 감염 된 세포의 주파수에 있는 감소를 유도 하지 못했습니다.
에이즈 식 비효율적인 접합16 곱하기 접합된 HIV RNA (MS RNA)17의 핵 수출에서 결함에 의해 더 제한 될 수 있습니다. 따라서, 식별 새로운 유형의 LRAs 더 강력한 바이러스 생산 후 통합의 영향을 미칠 수 필요 합니다. 또한, 대기 시간을 효율적으로 반대로 최적의 화합물을 정의 하는 데 도움이 소설 분석 실험의 개발이 필요 합니다.
여기, 프로토콜 제공 됩니다, 에이즈 LTR 기반 전사 및 접합에 개입의 영향의 기능 평가 위한 높은 처리량 접근 활용. 간단 하 게, 새로운 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 시스템 pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (그림 1) cytometry HIV 재 활성화를 평가 하기 위해 사용 됩니다. 이 형광 기자에서 unspliced HIV mRNA (4 kb)의 식 접합된 mRNA (2 kb)의 표현 Discosoma sp. 레드 (DsRed) 형광 단백질 표정으로 이어질 것 이라고 하는 동안 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식에 지도 한다. 간단히, 형광 환경을 EGFP 융해 단백질, gp140unc를 사용 했습니다. EGFP, EGFP의 코딩 시퀀스 봉투 (Env) 유엔 쪼개진 고 잘린 형태의 프레임에 배치 했다 Ablate 분열 사이트에 gp120 그리고 gp41 EGFP 환경의 분리를 방지 하 고 올바른 접는 용이 하 게 하는 수용 성 환경을 아날로그 만드는 막 횡단 도메인 이전 gp160 단백질 자를 변경 도입 된 및 EGFP의 표현입니다. 셀 내에서 식에 따라 계 그것 4 kb 환경 을의 핵-세포질 수출을 중재 하는 핵에 localizes mRNA (RRE) 계 반응 요소와 상호 작용을 통해. Env의 잘림 gp120 그리고 gp41, A7 3′ 스플라이스 사이트 사이 RRE 타협 하지 않습니다. 이 시스템에 V-1에 접합 기증자 4 (SD4)를 결합 하 고 acceptor 7 (SA7) 2 kb의 생산에 결과 mRNA 아미노산 38에서 잘린 기능 비 계 단백질 인코딩 융합 DsRed 형광 단백질, RevΔ38-DsRed. 간단히, DsRed 중첩 확장18아미노산 38에 레 브의 2nd exon에 삽입 되었다. Unspliced mRNA의 핵 수출을 촉진 하기 위하여 포유류 표정 벡터 계 (pCMV-레 브NL4.3) 인코딩 형광 기자 구조 (그림 2)와 페 공동 했다. 여기에 설명 된이 독특한 기자 구문 HIV 전사 및 접합, 바이러스 성 벡터를 사용 하지 않고도 높은 처리량 평가에 유용 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo 바이러스 재 활성화를 측정에 어려움을 감안할 때, 모델 시간 내내 latently 포함 HIV 대기 시간을 공부 하기 위하여 개발 되었다 생체 외에서 다양 한 범위의 감염 T 세포-라인 (J-라트, ACH2, u 1), (휴식의 잠재 감염의 기본 모델 O’Doherty, Lewin, 그린 및 Spina 모델) 또는 미리 활성화 된 CD4 + T 세포 (Sahu, 마리니, Planelles, Siliciano, 깐 모델) 단일 라운드 또는 복제 유능한 기자 바이러스22….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 프로젝트 그랜트 APP1129320 및 호주의 NHMRC에서 프로그램 그랜트 APP1052979에 의해 지원 되었다. 우리가이 작업의 성공적인 완료를 위한 필수 구문 및 통보를 제공 하기 위한 박사 아담 틀리는, 박사 마리나 알렉산더, 박사 제니 L. 앤더슨과 미셸 Y.이 감사 합니다. 우리는 또한 그들의 조언과이 연구에 사용 된 교류 cytometer 유지에 관대 한 지원에 대 한 DMI 흐름 시설 직원을 감사 합니다.
Materials
| Cell culture | |||
| HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) | ATCC | CRL-3216 | Replicates vectors carrying the SV40 region of replication. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) | Gibco | 10569-010 | + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10099-141 | Origin Australia |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4458 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Trypan blue Stain, 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I (1x) reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Serum free medium |
| NucleoBond Xtra Maxi | Marcherey-Nagel | 740414.50 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech (TaKaRa) | 6085-1 | Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pDsRed-Express-N1 | Clontech (TaKaRa) | 632429 | Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter. |
| pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed | Addgene | 115775 | |
| pCMV-RevNL4.3 | Addgene | 115776 | |
| pCMV-Tat101AD8-Flag | Addgene | 115777 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore | 67-68-5 | |
| JQ1(+) | Cayman Chemical | 11187 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| JQ1(-) | Cayman Chemical | 11232 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 16561-29-8 | Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM |
| Phytohaemagglutinin (PHA) | Remel | HA15/R30852701 | Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL |
| Vorinostat (VOR) | Cayman Chemical | 10009929 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM |
| Panobinostat (PAN) | TRC | P180500 | Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | 63581 | |
| Venor GeM Classic | Minerva Biolabs | 11-1100 | Mycoplasma Detection Kit, PCR-based |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry reagents | |||
| LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow) | |
| LSR II | BD Biosciences | Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet) | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34976 | Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit. |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| EDTA 0.5M pH8 | Gibco | 15575-038 | |
| Formaldehyde Solution 37/10 (37%) | Chem-Supply | FA010 | |
| BD FACS Diva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Calibration beads |
| Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) | BD Biosciences | 559123 | 3.0 – 3.4 mm |
| Sheath solution | Chem-Supply | SA046 | 90 g NaCl in 10 L water |
| HAZ-Tabs | Guest Medical | H8801 | Chlorine release tablets for disinfection |
| Decon 90 | Decon Laboratories Limited | N/A | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%. |
| Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) | Labco | SODHYPO-5L | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%. |
| 7x | MPBio | IM76670 | Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) | Corning | 430641U | |
| Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) | Costar | 3599 | |
| Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) | Costar | 3896 | |
| Centrifuge tubes (10 mL) | SARSTEDT | 62.9924.284 | 100×16 mm |
| Centrifuge tubes (50 mL) | CellStar | 227261 | 30×115 mm |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Corning Axygen | MCT-150-C | |
| Serological Pipette (25 mL), sterile | Corning | CLS4489-200EA | |
| Serological Pipette (10 mL), sterile | Corning | CLS4488-200EA | |
| Serological Pipette (5 mL), sterile | Corning | CLS4487-200EA | |
| Reagent reservoirs (50 mL), sterile | Corning | CLS4470-200EA | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap | Corning | 352235 | 12 x 75 mm style, 70 mm |
| Nylon Mesh | SEFAR | 03-100/32 | 100 mm |
| Titertube Micro test tubes, bulk | BIO-RAD | 2239391 | microfacs tubes |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap | Corning | 352008 | 12×75 mm style |
| Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes | Corning | 352032 | |
| Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) | ProSciTech | SVZ4NIOU | 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2 |
| Coverslips (Menzel-Gläser) | Grale Scientific | HCS2026 | 20 x 26 mm |
| Microscope | Nikon TMS | 310528 | |
| Centrifuge 5810R refrigerated | Eppendorf | 5811000487 | with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes |
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | N/A | Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| FACS Diva | BD Biosciences | Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1 | |
| FlowJo | FlowJo | FlowJo 10.4.2 | Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481 |
| Omega | BMG Labtech | FLUOstar multi-user reader control, version 5.11 | |
| Omega – Data Analysis | BMG Labtech | MARS | FLUOstar data analysis, version 3.20R2 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Excel:mac 2011 | version 14.0.0 |
| Prism | GraphPad | Prism 7 | version 7.0c |
References
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