Summary

إنتاجية عالية في تقييم المختبر من الكمون عكس الوكلاء عن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط

Published: January 22, 2019
doi:

Summary

بروتوكول إنتاجية عالية للتقييم الوظيفي لتنشيط فعالية فيروس نقص المناعة البشرية وتخليصها من بروفيروسيس الكامنة الموصوفة ويطبق اختبار أثر التدخلات بشأن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط. وترد نتائج تمثيلية لتأثير الكمون عكس الوكلاء على النسخ التي يحركها لتر والربط.

Abstract

وما زال فيروس نقص المناعة البشرية المستعصية بسبب وجود مستودع للخلايا التي تأوي شكل مستقر والكامنة للفيروس، الذي يبقى غير مرئية للجهاز المناعي، وهي ليست موجهة بالعلاج المضاد للفيروسات الرجعية الحالية (عربة). قد ثبت النسخ والربط إلى تعزيز زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية-1 في استراحة خلايا CD4 + T. عكس الكمون باستخدام الكمون عكس وكلاء (لراس) في النهج “الصدمة وقتل” درست على نطاق واسع في محاولة لتطهير هذا الخزان ولكن لم تظهر حتى الآن أي نجاح في التجارب السريرية بسبب الافتقار إلى التنمية الصغيرة الكافية الجزيئات التي يمكن التشويش كفاءة هذا الخزان. ينص البروتوكول على المقدمة هنا طريقة لموثوقية وكفاءة تقييم الكمون عكس وكلاء (لراس) في النسخ فيروس نقص المناعة البشرية والربط. ويستند هذا النهج استخدام يحركها لتر لون مزدوج مراسل وكالة فرانس أنه في نفس الوقت يمكن قياس الأثر جيش الرب للمقاومة على النسخ والربط بالتدفق الخلوي. بروتوكول الموصوفة هنا كاف للخلايا ملتصقة، فضلا عن الخلايا الموجودة في التعليق. أنها مفيدة لاختبار عدد كبير من الأدوية في نظام إنتاجية عالية. الأسلوب من الناحية التقنية البسيطة لتنفيذ وفعالية من حيث التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام التدفق الخلوي يسمح تقييم سلامة الخلية وهكذا المخدرات سمية في نفس الوقت.

Introduction

وعلى الرغم من فعالية العلاج المضاد للفيروس طويلة الأجل، استمرت فيروس نقص المناعة البشرية في حالة كامنة بروفيروس متكاملة في الذاكرة خلايا CD4 + “تي”1. هيكل الكروماتين من فيروس نقص المناعة البشرية-1 5 ‘ المروج تكرار طويلة طرفية (لاتينية) وتعديلات جينية مثل مثلايشن هيستون وديسيتيلاتيون بالحمض النووي ميثيلترانسفيراسيس (دنمت) وهيستون ديسيتيلاسيس (هداك) هي آليات هامة تؤدي إلى النسخي القمع ومن ثم التكامل بعد الكمون2،3. مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكمون عكس وكلاء (لراس) قد تم التحقيق لفعاليتها للحث على إنتاج الفيروس في المختبر وخفية في المجراة من المصابين في استراحة CD4 + “تي” الخلايا4،،من56،7 ،8. بين لراس اختبارها، هداسي (مثبطات HDAC) وبيت برومودومين مثبطات (بيتيس) حمل ديكوندينسيشن الكروماتين والإفراج عن النسخ الإيجابية استطالة عامل ب (P-تيفب) على التوالي، والمؤدية إلى اللاحقة التخفيف من النسخي القمع في 5 ‘ لتر والتنشيط لفيروس نقص المناعة البشرية التعبير9،،من1011،،من1213. بيد أن حجم إعادة التنشيط التي حققتها هذه لراس كانت محدودة، كما لوحظ زيادة متواضعة فقط في الخلية المرتبطة أونسبليسيد فيروس نقص المناعة البشرية مرناً (الرنا لنا)، يدل على النسخ الفيروسية، السابقين فيفو14،15. الأهم من ذلك، فشلت هذه لراس أيضا للحث على تخفيض تواتر الخلايا المصابة خفية.

فيروس نقص المناعة البشرية التعبير لا يجوز تقييده كذلك بعدم كفاءة الربط16 فضلا عن عيوب في الصادرات النووية لضرب المقسمة “فيروس الحمض النووي الريبي” (الرنا MS)17. وبالتالي، هناك حاجة إلى تحديد فئات جديدة من لراس التي هي أكثر قوة، ويمكن أن تؤثر على جوانب متميزة من الفيروسات التكامل ما بعد الإنتاج. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب وضع فحوصات الرواية التي تساعد على تحديد المركبات الأمثل لكفاءة عكس الكمون.

ويرد هنا، بروتوكول، التي تستخدم نهجاً الفائق للوظيفية تقييم أثر التدخلات على النسخ التي يحركها “لتر فيروس نقص المناعة البشرية” والربط. وباختصار، لون مزدوجة جديدة يحركها لتر مراسل نظام pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/دسريد (الشكل 1) يستخدم لتقييم إعادة تنشيط فيروس نقص المناعة البشرية بالتدفق الخلوي. في هذا المراسل الفلورسنت، التعبير عن أونسبليسيد فيروس نقص المناعة البشرية مرناً (4 كيلوبايت) يؤدي إلى التعبير البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)، بينما التعبير عن مرناً المقسمة (2 kb) سيؤدي إلى تعبير البروتينات الفلورية ديسكوسوما sp. الحمراء (دسريد). بإيجاز، استخدمنا بروتين فلوري انصهار الحياة الفطرية-اجفب، gp140unc. اجفب، حيث كان وضع تسلسل الترميز اجفب في الإطار مع نموذج الأمم المتحدة ملصوق ومبتورا المغلف (الحياة الفطرية). وأدخلت تغييرات يجتذ الموقع الانقسام ومنع الانفصال من الحياة الفطرية في gp120 و gp41-اجفب، واقتطاع البروتين gp160 قبل المجال transmembrane خلق تناظرية الحياة الفطرية القابلة لذوبان، مما يسهل الطي الصحيحة و التعبير عن اجفب. عند التعبير داخل خلية، يموضع Rev لنواة حيث أنها تتوسط الصادرات النووية هيولى من 4 كيلو بايت الحياة الفطرية مرناً عن طريق التفاعل مع عنصر استجابة القس (رر). الاقتطاع من الحياة الفطرية لا يضر رر، التي تقع بين gp120 و gp41، وموقع الوصلة 3 ‘ A7. وفي هذا النظام، الربط في فيروس نقص المناعة البشرية-1 لصق المانحة 4 (SD4) ولصق يقبلون 7 (SA7) النتائج في إنتاج 2 ك. بايت تنصهر مرناً ترميز بروتين Rev غير وظيفية اقتطاع في 38 من الأحماض الأمينية للبروتينات الفلورية دسريد، RevΔ38-دسريد. بإيجاز، كان دسريد إدراج إكسون 2nd من رؤيا في الأحماض الأمينية 38 بتداخل ملحق18. لتسهيل الصادرات النووية مرناً أونسبليسيد، transfected ناقل تعبير الثدييات ترميز Rev (بكمف-القسNL4.3) كان يشترك مع بناء مراسل الفلورسنت (الشكل 2). هذا البناء الفريد مراسل الموصوفة هنا مفيدة في تقييم الفائق لفيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط، دون الحاجة إلى استخدام النواقل الفيروسية.

Protocol

ملاحظة: التحول وتسلسل الإجراءات للاستنساخ، ناقش18،19في أماكن أخرى. البروتوكولات هنا تبدأ من تعداء ناقلات التعبير الثدييات (الشكل 3). 1-تعداء الخلايا HEK293T مع مراسل اللون المزدوج بناء زراعة الخلايا HEK293T في المتوسطة ?…

Representative Results

وتظهر نتائج الممثل في الشكل 5 للتعبير عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 أونسبليسيد (اجفب)، وتقسم المنتجات (دسريد) بعد المعالجة بمثبطات برومودومين JQ1. JQ1(+) وتأت زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا معربا عن اجفب (FC 2.18 و 4.13 عبر [دمس] على التوالي; n = 3) يدل على النصوص…

Discussion

نظراً لصعوبة قياس تنشيط الفيروس السابقين فيفو، طائفة واسعة من المختبر ووضعت نماذج مع مرور الوقت من أجل دراسة زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية بما في ذلك خفية المصابة خطوط الخلايا T (J-لاتس لاتفيا، ACH2، U1)، النماذج الأولية للعدوى الكامنة ليستريح ( نماذج O’Doherty، لوين، وغرين والمشقوقه) أو خل?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

أيد هذا العمل المشروع منحة APP1129320 ومنحة برنامج APP1052979 من “تمويل لأستراليا”. ونحن نشكر الدكتور آدم ويتلي، الدكتور ألكسندر مارينا، والدكتور جيني L. أندرسون وميشيل يوسف لي لتقديم المشورة والبنيات الأساسية للنجاح في إنجاز هذا العمل. ونشكر أيضا موظفي مرفق تدفق DMI لتقديم المشورة والمساعدة السخية للحفاظ على سيتوميتير تدفق المستخدمة في هذه الدراسة.

Materials

Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) ATCC CRL-3216 Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) Gibco 10569-010 + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum Gibco 10099-141 Origin Australia
Penicillin-Streptomycin Sigma P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
Trypan blue Stain, 0.4% Gibco 15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium Gibco 31985-070 Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi Marcherey-Nagel 740414.50
pEGFP-N1 plasmid Clontech (TaKaRa) 6085-1 Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1 Clontech (TaKaRa) 632429 Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed Addgene 115775
pCMV-RevNL4.3 Addgene 115776
pCMV-Tat101AD8-Flag Addgene 115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore 67-68-5
JQ1(+) Cayman Chemical 11187 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-) Cayman Chemical 11232 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Sigma-Aldrich 16561-29-8 Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA) Remel HA15/R30852701 Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR) Cayman Chemical 10009929 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN) TRC P180500 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega 63581
Venor GeM Classic Minerva Biolabs 11-1100 Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa BD Biosciences Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II BD Biosciences Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34976 Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
EDTA 0.5M pH8 Gibco 15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%) Chem-Supply FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) BD Biosciences 559123 3.0 – 3.4 mm
Sheath solution Chem-Supply SA046 90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs Guest Medical H8801 Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90 Decon Laboratories Limited N/A Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) Labco SODHYPO-5L Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x MPBio IM76670 Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) Corning 430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) Costar 3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) Costar 3896
Centrifuge tubes (10 mL) SARSTEDT 62.9924.284 100×16 mm
Centrifuge tubes (50 mL) CellStar 227261 30×115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Corning Axygen MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile Corning CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile Corning CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile Corning CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile Corning CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap Corning 352235 12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh SEFAR 03-100/32 100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk BIO-RAD 2239391 microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap Corning 352008 12×75 mm style
Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes Corning 352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) ProSciTech SVZ4NIOU 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser) Grale Scientific HCS2026 20 x 26 mm
Microscope Nikon TMS 310528
Centrifuge 5810R refrigerated Eppendorf 5811000487 with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech N/A Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
FACS Diva BD Biosciences Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo FlowJo FlowJo 10.4.2 Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega BMG Labtech FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega – Data Analysis BMG Labtech MARS FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel Microsoft Excel:mac 2011 version 14.0.0
Prism GraphPad Prism 7 version 7.0c

References

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure – The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency – reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).

Play Video

Cite This Article
Khoury, G., Purcell, D. F. High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing. J. Vis. Exp. (143), e58753, doi:10.3791/58753 (2019).

View Video