Summary

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

Published: January 22, 2019
doi:

Summary

HIV の効率的な再活性化の機能評価および潜在的な proviruses のクリアランスのための高いスループット プロトコル説明および HIV 転写の介入の影響をテストおよび選択的スプライシングによって適用しました。LTR 駆動の転写に対するエージェントの逆転と融着接続の遅延の効果の代表的な結果を提供しています。

Abstract

Hiv 感染細胞の貯水池、港湾の免疫システムには見えないままで、現在の抗レトロ ウイルス療法 (カート) では対象にならないウイルスの安定性と潜在的なフォームの存在により不治のまま。転写・ スプライシングは、静止 cd4 陽性 T 細胞の hiv-1 潜伏を補強するために示されています。「衝撃と殺す」アプローチにおける待機時間逆転剤 (LRAs) の使用による潜時の逆転この貯水池をパージする試みで広く研究されているが、ない十分な小型の開発の欠乏のための臨床試験にも成功を示しているこれまでのところ分子を効率的にこの貯水池を混乱させることができます。ここで提示されたプロトコルは、確実かつ効率的に HIV 転写待ち時間逆転エージェント (LRAs) の評価と選択的スプライシングのメソッドを提供します。このアプローチは、フローサイトメトリーによる転写、スプライシング、LRA の効果を同時に測定することができます LTR 駆動のデュアル カラー記者の使用に基づいています。ここで説明されているプロトコルは付着性のセルとして懸濁液の細胞に適しています。高スループットのシステムで多数の薬をテストするために便利です。シンプルに実装してコスト効果の高い方法は技術的にあります。また、フローサイトメトリーの使用セル実行可能性の評価を可能にし従って同時に毒性の薬物。

Introduction

効果的な長期的な抗レトロ ウイルス療法にもかかわらず HIV は潜伏状態でメモリー cd4 陽性 T 細胞1の統合 provirus として保持します。HIV 1 5 のクロマチン構造 ‘ 長いターミナル繰り返し (方向 LTR) のプロモーターとエピジェネティック修飾ヒストンのメチル化、脱アセチル化ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) し、DNA メチル基転移酵素 (DNMT) などにつながる重要なメカニズムは、転写抑制およびこうして統合後待機時間2,3。In vitro におけるウイルス産生を誘導するため待機時間逆転エージェント (LRAs) の大きい変化を調べたし、から生体内で潜在感染休憩 cd4 陽性 T 細胞4,5,6,7 ,8。LRAs 間テスト、HDACi (HDAC の抑制剤)、ベット ブロモ ドメイン阻害剤 (ベティス) クロマチン decondensation と正の転写伸長因子 b (P TEFb) のリリースをそれぞれ誘導する、転写の緩和以降につながる5′ LTR の抑圧と HIV 式9,1011,12,13の活性化。ただし、ex vivo14,15だけ細胞の, HIV mRNA (米国 RNA)、ウイルスの転写を示すものの緩やかな増加がみられたように、これら LRAs により再活性化量は限られていた。重要なは、これら LRAs も潜伏感染細胞の頻度の低下を誘導するために失敗しました。

HIV 式は、スプライシングは、乗算の HIV RNA (MS RNA)17の核外輸送の欠陥と同様、非能率的なスプライシング16によってさらに制限があります。したがってより強力なウイルス生産統合後の異なる側面に影響を与えることができます LRAs の識別の新しいクラスが必要です。さらに、効率的に待機時間を逆に最適な化合物の定義に役立つ新規アッセイの開発が必要です。

ここでは、プロトコルが表示され、HIV LTR 駆動転写、スプライシングの介入の影響の機能評価のための高スループット アプローチを利用します。簡単に言えば、新しい LTR 駆動のデュアル レポーター システム pLTR.gp140/EGFP を色します。RevΔ38/下流 (図 1) は、フローサイトメトリーによって hiv 感染の再活性化を評価するために使用されます。スプライシングは、mRNA (2 kb) の式はDiscosoma の sp赤 (下流) の蛍光蛋白質の表現につながるこの蛍光レポーターで, HIV mRNA (4 kb) の発現は強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 式に します。簡単に言えば、蛍光の Env EGFP の融合蛋白質は、gp140unc を使用しました。EGFP、EGFP のコーディング シーケンスが封筒 (Env) の非劈開と切り捨てられた形でフレームに配置された場所。Gp120 と gp41 EGFP、Env の解離を防ぐ胸の谷間サイトをアブレーションする可溶性の Env のアナログは、正しい折り畳みが容易になりますを作成する膜貫通ドメイン前 gp160 タンパク質を切り捨てるため、変更が導入されたとEGFP の発現。それが 4 kb のenvの核細胞質の輸出を仲介する核に局在する Rev セル内の式、時 rev 応答要素 (RRE) との相互作用を介して mRNA。Env の切り捨て gp120 と gp41、A7 3′ スプライス部位のある RRE 妥協をしません。このシステムは、HIV – 1 選択的スプライシング ドナー 4 (SD4) をスプライスし、スプライスの受容体 7 (SA7) 結果は 2 kb の mRNA Rev の非機能性タンパク質アミノ酸 38 で切り捨てをエンコード融合した DsRed 蛍光蛋白質、RevΔ38 下流に。簡単に言えば、下流は重複延長18アミノ酸 38 で Rev の 2ndエクソンに挿入されました。MRNA の核輸出を容易にするには、エンコード Rev (pCMV RevNL4.3) 哺乳類発現ベクターは蛍光レポーター構成 (図 2) と co transfected だった。ここで説明したこのユニークな記者のコンス トラクターは、HIV 転写とウイルスのベクトルを使用することがなく、スプライシングの高スループット評価に便利です。

Protocol

注:クローン作成手順については、変換とシーケンスは、18,19を別の場所で説明します。本プロトコルは哺乳動物発現ベクター (図 3) の導入から開始します。 1. デュアル カラー記者と HEK293T 細胞のトランスフェクションを構築します。 ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% (v/v) ウシ胎?…

Representative Results

HIV-1 の式 (EGFP), こさと次のブロモ ドメイン阻害剤 JQ1 による治療 (下流) 製品の代表的な結果は図 5のとおりです。JQ1(+) と Tat 大幅 EGFP を発現する細胞の割合を増加させた (DMSO を 2.18 と 4.13 FC それぞれ; n = 3), 成績証明書を示す。また、Tat と似たようなレベルにスプライシング製品 (DMSO 上 7.37 FC) の割合だけでなく、下流 (DMSO に 46.6 FC) を発現する…

Discussion

測定前のヴィヴォ ウイルス再活性化の難しさを考えると、モデルは、潜伏を含む HIV 待ち時間を研究するために時間をかけて開発された生体外で幅広い感染 T 細胞-ライン (J-ラッツ、ACH2、U1)、(の休息の潜在的な感染症の主要なモデルO ‘ doherty、レヴィン、グリーン、スピナ モデル) または事前活性化 cd 4 + T 細胞 (サフ、マリーニ、Planelles、Siliciano、カーン モデル) 単一のラウンドまたはレプ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、プロジェクト助成金 APP1129320 とオーストラリアの NHMRC からのプログラム助成金 APP1052979 によって支持されました。この仕事の成功の不可欠な構成要素とアドバイスを提供するため博士アダム ウィートリー、博士マリーナ アレクサンダー、ジェニー l. アンダーソン博士とミシェル Y. リーに感謝します我々 はまた、彼らのアドバイスや本研究で使用される流れの cytometer を維持するために寛大な支援の DMI の流れ施設スタッフを感謝します。

Materials

Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) ATCC CRL-3216 Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) Gibco 10569-010 + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum Gibco 10099-141 Origin Australia
Penicillin-Streptomycin Sigma P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
Trypan blue Stain, 0.4% Gibco 15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium Gibco 31985-070 Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi Marcherey-Nagel 740414.50
pEGFP-N1 plasmid Clontech (TaKaRa) 6085-1 Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1 Clontech (TaKaRa) 632429 Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed Addgene 115775
pCMV-RevNL4.3 Addgene 115776
pCMV-Tat101AD8-Flag Addgene 115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore 67-68-5
JQ1(+) Cayman Chemical 11187 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-) Cayman Chemical 11232 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Sigma-Aldrich 16561-29-8 Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA) Remel HA15/R30852701 Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR) Cayman Chemical 10009929 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN) TRC P180500 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega 63581
Venor GeM Classic Minerva Biolabs 11-1100 Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa BD Biosciences Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II BD Biosciences Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34976 Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
EDTA 0.5M pH8 Gibco 15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%) Chem-Supply FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) BD Biosciences 559123 3.0 – 3.4 mm
Sheath solution Chem-Supply SA046 90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs Guest Medical H8801 Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90 Decon Laboratories Limited N/A Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) Labco SODHYPO-5L Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x MPBio IM76670 Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) Corning 430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) Costar 3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) Costar 3896
Centrifuge tubes (10 mL) SARSTEDT 62.9924.284 100×16 mm
Centrifuge tubes (50 mL) CellStar 227261 30×115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Corning Axygen MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile Corning CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile Corning CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile Corning CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile Corning CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap Corning 352235 12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh SEFAR 03-100/32 100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk BIO-RAD 2239391 microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap Corning 352008 12×75 mm style
Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes Corning 352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) ProSciTech SVZ4NIOU 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser) Grale Scientific HCS2026 20 x 26 mm
Microscope Nikon TMS 310528
Centrifuge 5810R refrigerated Eppendorf 5811000487 with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech N/A Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
FACS Diva BD Biosciences Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo FlowJo FlowJo 10.4.2 Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega BMG Labtech FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega – Data Analysis BMG Labtech MARS FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel Microsoft Excel:mac 2011 version 14.0.0
Prism GraphPad Prism 7 version 7.0c

References

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Cite This Article
Khoury, G., Purcell, D. F. High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing. J. Vis. Exp. (143), e58753, doi:10.3791/58753 (2019).

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