Summary

Высокая пропускная способность в Vitro оценки задержки вспять агентов на ВИЧ транскрипции и сращивания

Published: January 22, 2019
doi:

Summary

Высокая пропускная способность протокол для функциональной оценки ВИЧ эффективного возобновления и распродажа скрытой proviruses описано и применяется тестирование воздействия мероприятий по ВИЧ транскрипции и сплайсинга. Представитель результаты эффекта задержки вспять агентов по инициативе LTR транскрипции и сплайсинга предоставляются.

Abstract

ВИЧ остается неизлечимой вследствие существования водохранилища клетки, который затаивает стабильной и скрытая форма вируса, который остается невидимым для иммунной системы и не является объектом текущего антиретровирусной терапии (корзину). Было показано, что транскрипция и сплайсинга укрепить задержки ВИЧ-1 в отдыха CD4 + Т-клеток. Реверсирование задержки с помощью задержки разворота агентов (МРВ) в «шока и убить» подход подробно изучена в попытке очистить этот водоем, но показал таким образом далеко не любой успех в клинических испытаниях из-за отсутствия развития адекватного малых молекул, которые могут эффективно возмущают это водохранилище. Представленные здесь протокол предоставляет метод для надежно и эффективно оценки задержка разворота агентов (МРВ) на транскрипцию ВИЧ и сплайсинга. Этот подход основан на использовании LTR-driven двойной цвет репортер, который может одновременно измерить эффект ЛРА на транскрипции и сплайсинга проточной цитометрии. Протокол, описанные здесь является адекватным для адэрентных клеток, а также клеток в суспензии. Это полезно для тестирования большое количество наркотиков в высокой пропускной способности системы. Метод является технически простой для выполнения и экономически эффективным. Кроме того использование проточной цитометрии позволяет оценить жизнеспособность клеток и таким образом наркотиков токсичности в то же время.

Introduction

Несмотря на эффективную долгосрочную антиретровирусной терапии ВИЧ сохраняется в состоянии скрытой как комплексной Провирус в памяти клеток CD4 + T1. Структура хроматина ВИЧ-1 5′ долго терминала повторить (LTR) промоутер и Эпигенетические модификации, такие как метилирование гистонов и диацетилморфина ДНК methyltransferases (DNMT) и гистонов комплексы (HDAC) являются важными механизмами, ведущих к транскрипционный анализ репрессий и, таким образом, задержка после интеграции2,3. Большое разнообразие задержка обратного агентов (МРВ) исследована для их эффективности побудить вирус производства в пробирке и в естественных условиях от латентно инфицированных отдыха CD4 + T клетки4,5,6,7 ,8. Среди МРВ испытания, HDACi (ингибиторы ГДАЦ) и ставка bromodomain ингибиторы (Бетис) вызвать decondensation хроматина и выпуска позитивные транскрипции удлинение фактор b (P-TEFb) соответственно, ведет к последующей освобождает от транскрипционный анализ репрессии на 5′ LTR и активации ВИЧ выражение9,10,11,12,13. Однако масштабы оживления, достигнутый этими МРВ был ограничен, как было отмечено лишь незначительное увеличение связанные ячейки unspliced ВИЧ мРНК (нас РНК), свидетельствует о вирусных транскрипции, ex vivo14,15. Важно отметить, что эти МРВ также удалось вызвать снижение частоты латентно инфицированных клеток.

ВИЧ выражение может быть ограничено неэффективных сплайсинга16 , а также дефекты в ядерного экспорта умножить сращивания РНК ВИЧ (РНК MS)17. Таким образом необходимы выявления новых классов МРВ, которые являются более мощными и могут влиять на различные аспекты вируса производства после интеграции. Кроме того развитие новых анализов, которые помогают определение оптимального соединения эффективно обратить задержка не требуется.

Здесь представлен протокол, который использует подход высокой пропускной способностью для функциональной оценки воздействия мероприятий по ВИЧ LTR-driven транскрипции и сплайсинга. Короче говоря новой инициативе LTR двойной цвет репортер системы pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (рис. 1) используется для оценки ВИЧ реактивации проточной цитометрии. В этом флуоресцентные репортер выражение unspliced ВИЧ мРНК (4 КБ) приводит к расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) выражение, в то время как выражение mRNA сращивания (2 kb) приведет к выражению флуоресцентный белок Discosoma sp. красный (DsRed). Вкратце мы использовали флуоресцентный протеин сплавливания Env-EGFP, gp140unc. EGFP, где кодирующая последовательность EGFP был помещен в рамку с ООН рассеченного и усеченной форме конверта (Env). Изменения были введены к удалять сайт расщепления, предотвращая диссоциации Env в gp120 и gp41-EGFP и усечение гп160 белка до трансмембранного домена, создание растворимых Env аналог, который облегчает правильно складывать и выражение EGFP. Выражение в ячейке, Rev локализуется в ядро, где она является посредником при ядерной цитоплазматического экспорта 4 КБ env мРНК через взаимодействие с элементом гибкой rev (RRE). Усечение Env не компромисс RRE, который лежит между gp120 и gp41 и A7 3′ сращивания сайта. В этой системе, сплайсинга ВИЧ-1 сращивания доноров 4 (SD4) и сращивания акцептора 7 (SA7) результатов в производстве 2 КБ мРНК кодирования нефункциональные Rev белка, усечены в аминокислоту 38 сливается с DsRed флуоресцентный белок, RevΔ38-DsRed. Вкратце DsRed был вставлен в 2-го экзона Rev на аминокислоты 38 путем перекрытия расширение18. Чтобы облегчить ядерного экспорта unspliced мРНК, млекопитающих выражение вектор кодирования Rev (NL4.3pCMV-Rev) была совместно transfected с помощью флуоресцентных репортер конструкции (рис. 2). Этот уникальный репортер конструкции, описанный здесь полезен в высок объём оценки ВИЧ транскрипции и сращивания, без необходимости использования вирусных векторов.

Protocol

Примечание: Процедуры для клонирования, трансформации и последовательности, рассматриваются в других18,19. Протоколы здесь начинаются от трансфекции млекопитающих выражение векторов (рис. 3). 1. transfection клеток HEK293T с дв…

Representative Results

Представитель результаты показаны на рисунке 5 выражение ВИЧ-1 unspliced (EGFP) и сращивания продуктов (DsRed) после лечения с bromodomain ингибитор СВ1. JQ1(+) и ТАТ значительно увеличилась доля клеток, выражая EGFP (2.18 и 4.13 ФК над ДМСО соответственно; n = 3) свидетельствует о u…

Discussion

Учитывая трудности в области измерения реактивации вируса ex vivo, широкий спектр в пробирке, которые со временем были разработаны модели для изучения задержка ВИЧ, включая латентно инфицированных клеток T линии (J-латов, АЧ2, U1), основной модели латентной инфекции отдыха) O’Doherty, Левин, Грин и…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана проект Грант APP1129320 и Грант APP1052979 программы от NHMRC Австралии. Мы благодарим д-р Адам Wheatley, д-р Марина Александр, д-р Дженни л Андерсон и Мишель ю. ли за предоставление основных конструкций и советы для успешного завершения этой работы. Мы также благодарим сотрудников DMI потока объекта за их советы и щедрой помощи в поддержании проточный цитометр, используемые в данном исследовании.

Materials

Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) ATCC CRL-3216 Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) Gibco 10569-010 + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum Gibco 10099-141 Origin Australia
Penicillin-Streptomycin Sigma P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
Trypan blue Stain, 0.4% Gibco 15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium Gibco 31985-070 Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi Marcherey-Nagel 740414.50
pEGFP-N1 plasmid Clontech (TaKaRa) 6085-1 Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1 Clontech (TaKaRa) 632429 Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed Addgene 115775
pCMV-RevNL4.3 Addgene 115776
pCMV-Tat101AD8-Flag Addgene 115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore 67-68-5
JQ1(+) Cayman Chemical 11187 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-) Cayman Chemical 11232 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Sigma-Aldrich 16561-29-8 Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA) Remel HA15/R30852701 Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR) Cayman Chemical 10009929 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN) TRC P180500 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega 63581
Venor GeM Classic Minerva Biolabs 11-1100 Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa BD Biosciences Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II BD Biosciences Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34976 Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
EDTA 0.5M pH8 Gibco 15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%) Chem-Supply FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) BD Biosciences 559123 3.0 – 3.4 mm
Sheath solution Chem-Supply SA046 90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs Guest Medical H8801 Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90 Decon Laboratories Limited N/A Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) Labco SODHYPO-5L Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x MPBio IM76670 Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) Corning 430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) Costar 3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) Costar 3896
Centrifuge tubes (10 mL) SARSTEDT 62.9924.284 100×16 mm
Centrifuge tubes (50 mL) CellStar 227261 30×115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Corning Axygen MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile Corning CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile Corning CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile Corning CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile Corning CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap Corning 352235 12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh SEFAR 03-100/32 100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk BIO-RAD 2239391 microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap Corning 352008 12×75 mm style
Snap Caps for 12×75 mm Test Tubes Corning 352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) ProSciTech SVZ4NIOU 3×3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser) Grale Scientific HCS2026 20 x 26 mm
Microscope Nikon TMS 310528
Centrifuge 5810R refrigerated Eppendorf 5811000487 with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech N/A Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
FACS Diva BD Biosciences Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo FlowJo FlowJo 10.4.2 Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega BMG Labtech FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega – Data Analysis BMG Labtech MARS FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel Microsoft Excel:mac 2011 version 14.0.0
Prism GraphPad Prism 7 version 7.0c

References

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure – The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency – reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).

Play Video

Cite This Article
Khoury, G., Purcell, D. F. High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing. J. Vis. Exp. (143), e58753, doi:10.3791/58753 (2019).

View Video