İki fotonlu Intravital mikroskobu kullanılarak grip virüsü enfeksiyonu sırasında trakeal mukozasında görüntüleme hücre etkileşimi
Summary
Bu çalışmada, biz iki fotonlu intravital görüntüleme ve hücre etkileşim fare trakeal mukoza grip virüsü ile enfeksiyon sonra çözümlemesi için bir protokol mevcut. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücre dynamics sırasında solunum yolu enfeksiyonları eğitim araştırmacılar için ilgili olacaktır.
Abstract
Hücre-hücre ya da hücre-patojen etkileşim içinde vivo analizini enfeksiyon bağışıklık yanıtının dinamiklerini anlamak önemli bir araçtır. İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) hücre etkileşimlerin gözlenmesi yaşayan hayvanlarda derin doku resim alma sırasında oluşturulan photobleaching en aza indirirken sağlar. Bugüne kadar farklı modeller için 2P-IVM lenfoid ve sigara lenfoid organlar tarif edilmistir. Ancak, bir meydan okuma hayvan solunum döngüsü ile ilişkili hareket nedeniyle solunum organlarının görüntüleme kalır.
Burada, in vivo bağışıklık hücre etkileşimlerde trakea 2 P-IVM kullanarak grip virüsü ile enfekte fareler görselleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu amaç için cerrahi pozlama ve nötrofil ve dendritik hücreler (DC) Mukozal epitel dinamik görüntülerini edinimi ardından trakea, entübasyon dahil özel bir görüntüleme platformu geliştirdi. Ayrıca, grip burunici enfeksiyon ve akış sitometrik bağışıklık hücrelerinin borusunda çözümlemesi için gereken adımları ayrıntılı. Son olarak, analiz ettik nötrofil ve DC hareketliliği gibi onların etkileşim bir film boyunca. Bu iletişim kuralı istikrarlı ve parlak 4 D görüntüleri oluşturmak için hücre-hücre etkileşimleri trakea değerlendirilmesi için gerekli sağlar.
Introduction
İki fotonlu intravital mikroskobu (2P-IVM) içinde onların doğal çevre1oluştuğunda gibi hücre hücre etkileşimlerin gerçek zamanlı görüntüleme için etkili bir tekniktir. Bu yöntemin ana avantajlarından biri hücresel süreçler diğer geleneksel görüntüleme teknikleri2ile karşılaştırıldığında daha büyük bir örnek Derinlik (1 mm için 500 µm) adlı çalışması sağlanmıştır. Aynı anda iki fotonlu lazer tarafından oluşturulan iki düşük enerjili fotonlar kullanımı genellikle görüntü alma işlemi2ile ilgili doku fotoğraf-zarar en aza indirir. Son on yılda 2P-IVM hücre-hücre etkileşimleri çeşitli disiplinleri3,4,5farklı türde çalışma uygulandı. Bu çalışmalar kendi yüksek dinamizm ve tanınmış kişiler diğer hücreleri ve çevre tarafından oluşturulan sinyalleri takip oluşumu ile karakterizedir bağışıklık hücreleri araştırmak özellikle ilgili olmuştur. 2P-IVM da patojen ve ana bilgisayar6arasındaki etkileşimler çalışma uygulandı. Nitekim, daha önce bazı patojenlerin engelleyici, sonuç olarak, immün yanıt7bağışıklık hücreleri arasında temas süresi ve türünü değiştirebilirsiniz gösterilmiştir.
Hava yolu mukoza bağışıklık yanıtı havadan patojenlere karşı olduğu ilk sitesi8oluşturulan olduğunu. Bu nedenle, bu doku etkileşimlerde patojen-ana bilgisayar analizini vivo içinde konak savunma mekanizmaları başlatılması sırasında enfeksiyon anlamak için önemlidir. Ancak, 2P-IVM solunum yolları, özellikle resim alma sürecinin ödün vermez hayvan solunum döngüsü tarafından üretilen eserler nedeniyle zordur. Son zamanlarda, farklı cerrahi modelleri görüntüleme fare trakea9,10,11,12 ve akciğerleri13,14,15‘anlatmıştık, 16. Trakeal 2P-IVM modelleri akciğer-alveoller 2 P-IVM modelleri enfeksiyonların geç faz çalışmaya daha uygun olmakla birlikte üst solunum yolları, bağışıklık reaksiyonu başlangıç aşamasında görselleştirmek için mükemmel bir set-up temsil eder. Lazer optik penetrasyon kısıtlamak ve intrapulmonary airways mukozal tabakasının içinde vivo 17 görüntüleme için erişilmez hale hava dolu alveoller varlığı ile ilişkili bir sınırlama Gelişmiş akciğer modelleri mevcut . Bunun tersi olarak, sürekli bir epitel tarafından kurulan trakea yapısını resim alma kolaylaştırır.
Burada, grip enfeksiyon, cerrahi hayvanlar hazırlanması ve 2 P-IVM trakea, gerçekleştirmek için gereken adımları ayrıntılı bir açıklamasını içeren bir protokolü mevcut. Buna ek olarak, belirli bir deneysel kurulum nötrofil ve dendritik hücreler (DC), grip virüsü18karşı,19 arabulucu savunma mekanizması olarak önemli bir rol oynamak iki bağışıklık hücre tipleri görselleştirme için tarif . Son olarak, nötrofil-DC etkileşimleri analiz etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Bu kişiler DC harekete geçirmek modüle gösterilmiştir ve daha sonra patojenler20karşı bağışıklık yanıtı etkileyecek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma adoptively transfer edilen nötrofil ve ilişkileri ile DC geçişi grip enfeksiyon sırasında fare borusunda gösterilen 4 D görüntüleri nesil için detaylı bir Protokolü sunar. Açıklanan 2P-IVM modeli bir solunum yolları enfeksiyonu sırasında bağışıklık hücre dinamiği çalışmaya ilgili olacak.
Son zamanlarda, çeşitli modeller hücre dinamiği içinde solunum yolları görselleştirme göre gelişmiş9,10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser İsviçre Ulusal Vakfı (SNF) hibe (176124, 145038 ve 148183), Avrupa Komisyonu Marie Curie Reintegration Grant (612742) ve SystemsX.ch D.U.P. için bir hibe için tarafından desteklenmiştir (2013/124).
Materials
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
- Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
- Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
- Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
- Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
- Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
- Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
- Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
- Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
- Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
- Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).
