Summary

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

Published: August 17, 2018
doi:

Summary

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur zwei-Photon intravitalen Bildgebung und Zelle Interaktionsanalyse in der murinen trachealen Schleimhaut nach Infektion mit Influenza-Virus führen. Dieses Protokoll wird für Forscher Immunzelle Dynamik bei Atemwegsinfektionen relevant sein.

Abstract

Die Analyse der Zell-Zell oder Zelle-Pathogen Interaktion in Vivo ist ein wichtiges Instrument zum Verständnis der Dynamik der Immunantwort auf eine Infektion. Zwei-Photonen-Mikroskopie intravitalen (2P-IVM) ermöglicht die Beobachtung des Zell-Interaktionen im tiefen Gewebe in lebenden Tieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz während der Bildaufnahme generiert. Bisher wurden verschiedene Modelle für 2P-IVM der lymphatischen und nicht-lymphatischen Organe beschrieben. Bildgebung der Atmungsorgane bleibt jedoch eine Herausforderung durch die Bewegung der Atemzyklus des Tieres zugeordnet.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur in-Vivo Immunzelle Interaktionen in der Luftröhre von Mäusen mit 2P-IVM mit Influenza-Virus infiziert zu visualisieren. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine benutzerdefinierte Image Plattform, die die chirurgische Exposition und Intubation der Trachea, gefolgt von der Übernahme von dynamischen Bildern von Neutrophilen und dendritischen Zellen (DC) in der Schleimhaut-Epithel enthalten. Darüber hinaus detaillierte wir die notwendigen Schritte zur Grippe intranasale Infektion und Flow durchflusszytometrischen Analyse von Immunzellen in der Luftröhre führen. Zu guter Letzt haben wir Neutrophilen sowie DC Motilität und deren Wechselwirkungen im Laufe eines Films analysiert. Dieses Protokoll ermöglicht für die Erzeugung von stabilen und helle 4-D-Bilder für die Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen in der Luftröhre.

Introduction

Zwei-Photonen-Mikroskopie intravitalen (2P-IVM) ist eine effektive Methode zur Echtzeit imaging von Zell-Zell-Interaktionen, wie sie in ihrer natürlichen Umgebung1vorkommen. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es die Untersuchung von zellulären Prozessen eine größere Tiefe der Probe (500 µm bis 1 mm ermöglicht) im Vergleich zu anderen herkömmlichen bildgebenden Techniken2. Zum gleichen Zeitpunkt minimiert den Verbrauch von zwei niederenergetischen Photonen durch die zwei-Photonen-Laser erzeugt die Foto-Gewebeschäden in typischer Weise mit dem Bild Erwerb Prozess2verbunden. Während des letzten Jahrzehnts ist 2P-IVM angewendet worden, um verschiedene Arten von Zell-Zell-Interaktionen in mehreren Disziplinen3,4,5zu studieren. Diese Studien wurden besonders relevant zu untersuchen Immunzellen, die sich durch ihre hohe Dynamik und die Bildung von prominenten Kontakte nach erzeugten Signale von anderen Zellen und Umwelt auszeichnen. 2P-IVM wurde auch angewendet, um die Wechselwirkungen zwischen Erreger und Wirt6zu studieren. In der Tat hat bisher gezeigt, dass einige Krankheitserreger die Art und Dauer der Kontakte zwischen Immunzellen behindern, infolgedessen die Immunantwort7verändern können.

Die Schleimhaut der Atemwege ist die erste Website, in der die Immunantwort gegen Krankheitserreger in der Luft ist,8erzeugt. In Vivo Analyse der Erreger-Wirt-Interaktionen in diesem Gewebe ist daher entscheidend für die Einleitung der Wirt Abwehrmechanismen während der Infektion zu verstehen. 2 P-IVM der Atemwege ist jedoch anspruchsvoll vor allem durch die Artefakte produziert von den Atemzyklus des Tieres, die den Prozess der Bildaufnahme beeinträchtigt. Vor kurzem wurden verschiedene chirurgische Modelle für bildgebende murinen Luftröhre9,10,11,12 und Lunge13,14,15beschrieben, 16. Trachealen 2P-IVM-Modelle stellen eine ausgezeichnete Einrichtung, die erste Phase der die Immunreaktion in den oberen Atemwegen zu visualisieren, während Lungen-Alveolen 2P-IVM Modelle besser geeignet sind, um der späten Phase der Infektion zu studieren. Die entwickelten Lunge Modelle präsentieren eine Einschränkung verbunden mit der Anwesenheit von luftgefüllten Alveolen, die optische Eindringtiefe des Lasers zu beschränken und die Darmschleimhaut des Hämoglobin Atemwege unzugänglich für in-Vivo imaging17 . Umgekehrt erleichtert die Struktur der Luftröhre, gebildet durch eine kontinuierliche Epithel Bildaufnahme.

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die eine detaillierte Beschreibung der auszuführenden Influenza-Infektion, chirurgische Vorbereitung der Tiere und 2P-IVM der Luftröhre erforderlichen Schritte enthält. Darüber hinaus beschreiben wir eine bestimmte Versuchsanordnung zur Visualisierung von Neutrophilen und dendritischen Zellen (DC), zwei Arten von Immunzellen, die eine wichtige als Vermittler der Abwehrmechanismus gegen Influenza Virus18,19 Rolle . Schließlich beschreiben wir ein Verfahren zur Neutrophilen-DC Interaktionen zu analysieren. Diese Kontakte haben gezeigt, dass DC-Aktivierung zu modulieren und anschließend auf die Immunantwort gegen Krankheitserreger20auswirken.

Protocol

Alle tierische Verfahren, die mit Mäusen, in Übereinstimmung mit dem Bundesamt für Veterinärwesen Richtlinien und tierischen Protokolle durchgeführt wurden wurden von den örtlichen Tierarzt Behörden genehmigt. 1. Influenza-Infektion CD11c-YFP Mäuse Biologische SicherheitHinweis: Die Maus angepasst-Stamm von A/Puerto Rico/8/34 H1N1 Influenza (PR8) war in befruchteten Eiern gewachsen, gereinigt und titriert als zuvor beschriebenen21….

Representative Results

In dieser Arbeit beschriebenen wir einem detaillierten Protokoll in Vivo zu studieren die Motilität und die Wechselwirkungen zwischen Neutrophilen und DC während der Influenza-Infektion in murinen Luftröhre (Abb. 3A). Zu diesem Zweck isoliert wir GFP+ Neutrophilen (92 % Reinheit; Abb. 3 b) von CK6-ECFP übertragen Mäuse und wir adoptively sie in eine CD11c-YFP Maus mit Grippe infiziert. Danach führten wir…

Discussion

Dieses Werk stellt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von 4D Bilder zeigen die Migration der adoptively übertragenen Neutrophilen und ihrer Wechselwirkungen mit DC während einer Influenza-Infektion in der Maus Luftröhre. Die beschriebenen 2P-IVM-Modell werden Immunzelle Dynamik während einer Infektion in den Atemwegen zu studieren.

Vor kurzem, wurden mehrere Modelle basieren auf der Visualisierung von Zelldynamik in den Atemwegen entwickelten9,<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF) Stipendien (176124, 145038 und 148183), der Europäischen Kommission Marie Curie Wiedereingliederungsbeihilfe (612742) und SystemsX.ch nach einer Finanzierungsmöglichkeit für D.U.P (2013/124).

Materials

Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1X) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20°C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20°C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20°C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

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Cite This Article
Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

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