Summary

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

Published: August 17, 2018
doi:

Summary

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Abstract

A análise da célula-célula ou célula-patógeno interação na vivo é uma ferramenta importante para compreender a dinâmica da resposta imune à infecção. Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) permite a observação das interações célula no tecido profundo em animais vivos, minimizando o fotobranqueamento gerado durante a aquisição de imagens. Até à data, têm sido descritos diferentes modelos para 2P-IVM dos órgãos linfoides e não linfoides. No entanto, a imagem de órgãos respiratórios permanece um desafio devido ao movimento associado com o ciclo de respiração do animal.

Aqui, descrevemos um protocolo para visualizar na vivo celular imune interações na traqueia de camundongos infectados com o vírus da gripe usando 2P-IVM. Para este fim, nós desenvolvemos uma plataforma de imagem personalizada, que incluía a exposição cirúrgica e intubação da traqueia, seguida pela aquisição de imagens dinâmicas de neutrófilos e células dendríticas (DC) no epitélio da mucosa. Além disso, nós detalhados os passos necessários para realizar a gripe intranasal infecção e fluxo cytometric análise de células do sistema imunológico na traqueia. Finalmente, analisamos neutrófilos e motilidade DC, bem como suas interações no decurso de um filme. Este protocolo permite a geração de imagens de 4D estável e brilhante necessário para a avaliação de interações célula-célula na traqueia.

Introduction

Dois fotões microscopia intravital (2P-IVM) é uma técnica eficiente para tempo real de imagens de célula para célula interações que ocorrem em seu ambiente natural1. Uma das principais vantagens deste método é que permite o estudo de processos celulares em uma maior profundidade de amostra (500 µm a 1 mm) comparado com outros tradicionais de técnicas de imagem2. Ao mesmo tempo, o uso de dois fótons de baixa energia gerada pelo laser dois fotões minimiza o foto-dano no tecido normalmente associado com o processo de aquisição de imagem2. Durante a última década, 2P-IVM foi aplicada para estudar diferentes tipos de interações célula-célula em várias disciplinas,3,4,5. Estes estudos foram especialmente relevantes para investigar as células imunes, que caracterizam-se pelo seu elevado dinamismo e a formação de contatos proeminentes seguindo os sinais gerados por outras células e o meio ambiente. 2P-IVM foi também aplicada para estudar as interações entre patógeno e hospedeiro6. Com efeito, anteriormente mostrou que alguns patógenos podem alterar o tipo e a duração dos contatos entre células do sistema imunológico, dificultando, assim, a resposta imune7.

A mucosa das vias aéreas é o primeiro site no qual a resposta imune contra patógenos no ar é gerado por8. Portanto, na vivo análise das interações patógeno-hospedeiro, este tecido é fundamental entender a iniciação dos mecanismos de defesa do hospedeiro durante a infecção. No entanto, 2P-IVM das vias aéreas é um desafio, principalmente devido os artefatos produzidos pelo ciclo de respiração do animal, que compromete o processo de aquisição de imagem. Recentemente, diferentes modelos cirúrgicos foram descritos para imagiologia murino traqueia9,10,11,12 e pulmões13,14,15, 16. 2P-IVM traqueal modelos representam um excelente set-up para visualizar a fase inicial da reação imune nas vias aéreas superiores, enquanto os alvéolos pulmonares 2P-IVM modelos são mais adequados para estudar a fase final das infecções. Os modelos de pulmão desenvolvidos apresentam uma limitação associada à presença de alvéolos cheios de ar, que restringir a penetração ótica do laser e fazer com que a camada da mucosa das vias aéreas intrapulmonares inacessíveis na vivo de imagem17 . Por outro lado, a estrutura da traqueia, formada por um epitélio contínuo, facilita a aquisição de imagens.

Aqui, apresentamos um protocolo que inclui uma descrição detalhada das etapas necessárias para realizar a infecção da gripe, preparação cirúrgica dos animais e 2P-IVM da traqueia. Além disso, descrevemos uma montagem experimental específica para a visualização de neutrófilos e células dendríticas (DC), dois tipos de células imunes que desempenham um papel importante como mediadores do mecanismo de defesa contra vírus de gripe18,19 . Finalmente, descrevemos um procedimento para analisar interações de neutrófilos-DC. Estes contactos foram mostrados para modular a ativação DC e, posteriormente, para afetar as respostas imunológicas contra patógenos20.

Protocol

Todos os procedimentos de animais envolvendo ratos foram realizados em conformidade com as orientações de veterinário Federal suíço e protocolos de animais foram aprovados pelas autoridades locais do veterinário. 1. gripe infecção de ratos CD11c-YFP BiossegurançaNota: A cepa de rato adaptado da gripe H1N1 de Rico/8/34 A/Puerto (PR8) foi cultivada em ovos fertilizados, purificada e titulada como descrito anteriormente,21. Todos os …

Representative Results

Neste trabalho, descrevemos um protocolo detalhado para estudar na vivo a motilidade e as interações entre os neutrófilos e DC durante a infecção da gripe na traqueia murino (Figura 3A). Para esta finalidade, isolamos neutrófilos PCP+ (92% de pureza; Figura 3B) de CK6-ECFP ratos e nos enviaram transferindo-os para um rato de CD11c-YFP infectado com gripe. Depois disso, foram realizadas 2P-IVM da traqueia…

Discussion

Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para a geração de imagens de 4D, mostrando a migração de neutrófilos enviaram transferidos e suas interações com DC durante uma infecção de gripe na traqueia do mouse. O modelo descrito 2P-IVM será relevante para estudar a dinâmica de células imunes durante uma infecção nas vias aéreas.

Recentemente, vários modelos com base na visualização da dinâmica celular das vias aéreas têm sido desenvolvidos9

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da Fundação Nacional Suíço (SNF) (176124, 145038 e 148183), o Europeu Comissão Marie Curie reintegração Grant (612742) e o SystemsX.ch de uma subvenção para D.U.P (2013/124).

Materials

Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1X) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20°C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20°C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20°C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

References

  1. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  2. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  3. Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
  4. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
  6. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  7. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  8. Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
  9. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
  10. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  11. Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
  12. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
  14. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
  15. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  16. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  17. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  18. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
  19. Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  20. van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
  21. Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
  22. Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  23. Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
  24. Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
  25. Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
  26. Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , (2018).
  27. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  28. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  29. Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
  30. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
  31. Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
  32. Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).

Play Video

Cite This Article
Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

View Video