Summary

تصوير تفاعل الخلية في الغشاء المخاطي الرغامى أثناء عدوى فيروس الإنفلونزا باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال اثنين-فوتون

Published: August 17, 2018
doi:

Summary

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لأداء اثنين-فوتون إينترافيتال التصوير وخلية تحليل التفاعل في الغشاء المخاطي الرغامى مورين بعد الإصابة بفيروس الإنفلونزا. سوف يكون هذا البروتوكول ذات الصلة للباحثين دراسة ديناميات الخلايا المناعية أثناء التهابات الجهاز التنفسي.

Abstract

تحليل خلية خلية أو خلية الممرض التفاعل في فيفو أداة هامة لفهم القوى المحركة للاستجابة المناعية للعدوى. اثنين-فوتون إينترافيتال المجهري (2 فناقلات الأمراض) يتيح مراقبة التفاعلات الخلية في الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية، مع التقليل من فوتوبليتشينج التي تم إنشاؤها أثناء الحصول على الصور. وحتى الآن، وقد وصف نماذج مختلفة للناقلات ف 2 من الأجهزة اللمفاوية وغير اللمفاوية. ومع ذلك، تصوير الأجهزة التنفسية لا يزال يشكل تحديا نظراً للحركة المرتبطة بدوره التنفس للحيوان.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتصور التفاعلات في فيفو الخلايا المناعية في القصبة الهوائية في الفئران المصابة بفيروس الإنفلونزا باستخدام ناقلات الأمراض ف 2. ولهذا الغرض، قمنا بتطوير منصة تصوير مخصصة، والتي تشمل التعرض الجراحية وتنبيب القصبة الهوائية، متبوعاً باقتناء الصور الديناميكية من العَدلات والخلايا الجذعية (DC) في ظهارة الغشاء المخاطي. بالإضافة إلى ذلك، نحن بالتفصيل الخطوات اللازمة للقيام بالإنفلونزا يعطي داخل الآنف العدوى وتدفق سيتوميتريك تحليل للخلايا المناعية في القصبة الهوائية. وأخيراً، قمنا بتحليل العَدلات وحركية العاصمة، فضلا عن تفاعلها وأثناء الفيلم. يسمح هذا البروتوكول لتوليد الصور 4 د مستقرة ومشرق اللازمة لتقييم التفاعلات خلية خلية في القصبة الهوائية.

Introduction

اثنين-فوتون إينترافيتال المجهري (2 فناقلات الأمراض) أسلوب فعال للوقت الحقيقي التصوير من خلية إلى خلية التفاعلات التي تحدث في البيئة الطبيعية على1. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب أنه يتيح دراسة العمليات الخلوية في عمق عينة أكبر (500 ميكرومتر إلى 1 ملم) بالمقارنة مع سائر تقنيات التصوير التقليدية2. في الوقت نفسه، يقلل استخدام اثنين الفوتونات منخفضة الطاقة المتولدة عن الليزر اثنين-فوتون تلف الأنسجة الصور المرتبطة عادة ب عملية اقتناء الصورة2. خلال العقد الماضي، طبق ف 2-ناقلات الأمراض لدراسة مختلف أنواع التفاعلات خلية في عدة تخصصات3،،من45. وكانت هذه الدراسات ذات الصلة وبخاصة للتحقيق في الخلايا المناعية، التي تتميز بديناميتها عالية وتشكيل جهات بارزة بعد الإشارات التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا الأخرى والبيئة. 2 فناقلات طبق أيضا على دراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة والمضيفة6. وفي الواقع، سابقا ثبت أن بعض العوامل الممرضة يمكن أن تغير نوع ومدة بالاتصالات بين الخلايا المناعية، تعوق الاستجابة المناعية7، نتيجة لذلك.

الغشاء المخاطي لمجرى الهواء هو أول موقع الاستجابة المناعية ضد العوامل الممرضة المحمولة جوا التي ولدت8. ولذلك، في فيفو تحليل التفاعلات المضيف الممرض في هذا النسيج أمر حاسم لفهم الشروع في آليات الدفاع المضيف أثناء الإصابة. 2 فناقلات الأمراض للخطوط الجوية غير صعبة أساسا نظراً للنتائج الملموسة التي تنتجها دورة التنفس للحيوان، الذي يعرض للخطر عملية الحصول على الصور. في الآونة الأخيرة، وقد وصف النماذج الجراحية المختلفة للتصوير القصبة الهوائية موريني9،10،11،12 والرئتين13،،من1415، 16. تمثل نماذج الرغامى ف 2-ناقلات الأمراض إعداد ممتاز لتصور المرحلة الأولى من رد فعل المناعة في الخطوط الجوية العليا، بينما نماذج ف 2-ناقلات الأمراض الرئة-الحويصلات الهوائية أكثر ملاءمة للدراسة في المرحلة المتأخرة من العدوى. نماذج الرئة المتقدمة هذا القيد المرتبطة بوجود الحويصلات الهوائية المملوءة بالهواء، التي تحد من اختراق الليزر الضوئية وجعل الطبقة المخاطية للخطوط الجوية الخزعات التي يتعذر الوصول إليها في فيفو التصوير17 . على العكس من ذلك، وهيكل القصبة الهوائية، التي شكلتها ظهارة مستمر، يسهل الحصول على الصور.

نقدم هنا، بروتوكولا يتضمن وصفاً مفصلاً للخطوات المطلوبة للقيام بعدوى الإنفلونزا، وإعداد العمليات الجراحية للحيوانات، وف 2-ناقلات الأمراض من القصبة الهوائية. وبالإضافة إلى ذلك، يصف لنا مجموعة تجريبية محددة للتصور من العَدلات والخلايا الجذعية (DC)، نوعين من الخلايا المناعية تلعب دوراً هاما كوسطاء لآلية الدفاع ضد فيروس الإنفلونزا18،19 . وأخيراً، يصف لنا إجراء تحليل التفاعلات العَدلات-DC. جهات الاتصال هذه قد ثبت أن تعدل DC التنشيط، ومن ثم تؤثر على الاستجابات المناعية ضد العوامل الممرضة20.

Protocol

وافق جميع الإجراءات الحيوان الفئران التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية “مكتب الطب البيطري الفدرالي السويسري” والبروتوكولات الحيوان سلطات بيطري محلي. 1. الإنفلونزا العدوى من الفئران CD11c-يفب السلامة الأحيائيةملاحظة: الماوس تكيف السلالة من الإنفلونزا H1N1 A/Puerto …

Representative Results

في هذا العمل، وصفناها بروتوكول مفصل للدراسة في فيفو الحركية والتفاعلات بين العَدلات والعاصمة أثناء الإصابة بالإنفلونزا في القصبة الهوائية مورين (الشكل 3A). لهذا الغرض، ونحن عزل الحراجية المعتمدة+ العَدلات (نقاء 92%؛ الشكل 3) من CK6-…

Discussion

ويعرض هذا العمل بروتوكول مفصل لتوليد صور 4 د تظهر هجرة العَدلات أدوبتيفيلي المنقولة وتفاعلاتها مع العاصمة خلال عدوى إنفلونزا في القصبة الهوائية الماوس. سوف يكون النموذج المبين ف 2-ناقلات الأمراض ذات الصلة لدراسة ديناميات الخلايا المناعية أثناء التهاب في الشعب الهوائية.

في …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيده هذا العمل منح المؤسسة الوطنية السويسرية (SNF) (176124 و 145038 و 148183) والأوروبية اللجنة ماري كوري إعادة الإدماج المنحة (612742)، و SystemsX.ch للحصول على منحة إلى D.U.P. (2013/124).

Materials

Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1X) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20°C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20°C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20°C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

References

  1. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  2. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  3. Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
  4. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
  6. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  7. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  8. Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
  9. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
  10. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  11. Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
  12. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694 (2017).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
  14. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
  15. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  16. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  17. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  18. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
  19. Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  20. van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
  21. Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
  22. Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  23. Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
  24. Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
  25. Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
  26. Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , (2018).
  27. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  28. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  29. Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
  30. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
  31. Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881 (2016).
  32. Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).

Play Video

Cite This Article
Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

View Video