Summary

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

Published: August 17, 2018
doi:

Summary

In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell’influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.

Abstract

L’analisi della cellula-cellula o cellula-patogeno interazione in vivo è uno strumento importante per capire la dinamica della risposta immunitaria all’infezione. Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) permette l’osservazione delle interazioni cellula nei tessuti profondi in animali viventi, riducendo al minimo il photobleaching generati durante l’acquisizione di immagini. Ad oggi, sono stati descritti diversi modelli per 2P-IVM degli organi linfoidi e non linfoidi. Tuttavia, la formazione immagine degli organi respiratori rimane una sfida a causa del movimento associata al ciclo di respirazione dell’animale.

Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare in vivo delle cellule immuni interazioni nella trachea di topi infettati con il virus dell’influenza utilizzando 2P-IVM. A questo scopo, abbiamo sviluppato una piattaforma di formazione immagine personalizzata, che comprendeva l’esposizione chirurgica e intubazione della trachea, seguita dall’acquisizione di immagini dinamiche dei neutrofili e cellule dendritiche (DC) nell’epitelio mucoso. Inoltre, abbiamo dettagliato i passaggi necessari per eseguire l’influenza intranasale infezione e flusso cytometric analisi delle cellule immuni nella trachea. Infine, abbiamo analizzato il neutrofilo e motilità DC così come le loro interazioni nel corso di un film. Questo protocollo permette per la generazione di immagini 4D stabile e luminose necessario per la valutazione delle interazioni cellula-cellula nella trachea.

Introduction

Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) è una tecnica efficace per l’imaging di tempo reale delle interazioni cellula-cellula che si verificano nel loro ambiente naturale1. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che permette lo studio di processi cellulari, a una maggiore profondità di campione (500 µm a 1 mm), rispetto ad altri di tecniche di imaging tradizionale2. Allo stesso tempo, l’uso di due fotoni di bassa energia generata dal laser del due-fotone minimizza il foto-danno di tessuto tipicamente associato con il processo di acquisizione immagine2. Durante l’ultimo decennio, 2P-IVM è stato applicato per lo studio di diversi tipi di interazioni cellula-cellula in diverse discipline3,4,5. Questi studi sono stati particolarmente rilevanti per indagare le cellule immuni, che sono caratterizzate dalla loro alta dinamicità e la formazione di importanti contatti seguendo i segnali generati da altre cellule e l’ambiente. 2P-IVM è stata applicata anche per studiare le interazioni tra patogeno e serie6. Infatti, precedentemente è stato indicato che alcuni agenti patogeni possono alterare il tipo e la durata dei contatti tra le cellule immunitarie, ostacolando, di conseguenza, la risposta immunitaria7.

La mucosa delle vie aeree è il primo sito in cui la risposta immunitaria contro agenti patogeni nell’aria è generato8. Pertanto, in vivo l’analisi delle interazioni agente patogeno-ospite in questo tessuto è fondamentale per comprendere l’iniziazione dei meccanismi di difesa ospite durante l’infezione. Tuttavia, 2P-IVM delle vie aeree è impegnativo pricipalmente dovuto i manufatti prodotti dal ciclo di respirazione dell’animale, che compromette il processo di acquisizione di immagini. Recentemente, sono stati descritti diversi modelli chirurgici per imaging trachea murino9,10,11,12 e polmoni13,14,15, 16. Tracheale 2P-IVM modelli rappresentano un ottimo set-up per visualizzare la fase iniziale della reazione immune nelle vie aeree superiori, mentre sono più adatti a studiare la fase tarda di infezioni del polmone-alveoli 2P-IVM modelli. I modelli sviluppati del polmone presentano una limitazione associata alla presenza degli alveoli riempiti d’aria, che limitano la penetrazione ottica del laser e rendere lo strato della mucosa delle vie aeree intrapolmonari inaccessibile per in vivo imaging17 . Al contrario, la struttura della trachea, formata da un epitelio continuo, facilita l’acquisizione di immagini.

Qui, presentiamo un protocollo che include una descrizione dettagliata dei passaggi necessari per eseguire l’infezione di riossidazione, preparazione chirurgica degli animali e 2P-IVM della trachea. In più, descriviamo un specifico set-up sperimentale per la visualizzazione dei neutrofili e cellule dendritiche (DC), due tipi di cellule immunitarie che svolgono un ruolo importante come mediatori del meccanismo di difesa contro l’influenza virus18,19 . Infine, descriviamo una procedura per analizzare le interazioni del neutrofilo-DC. Questi contatti sono stati indicati per modulare l’attivazione delle DC e, successivamente, di influenzare le risposte immunitarie contro gli agenti patogeni20.

Protocol

Tutte le procedure di animale che coinvolgono topi sono stati eseguiti secondo l’Ufficio federale di veterinaria indirizzi e protocolli animale sono state approvate dalle autorità veterinario locale. 1. influenza infezione dei topi CD11c-YFP BiosicurezzaNota: Il ceppo del mouse adattato di influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) è stato coltivato in uova fecondate, purificato e titolato come descritto in precedenza21. Tutti i passaggi ch…

Representative Results

In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per studiare in vivo la motilità e le interazioni tra neutrofili e DC durante l’infezione di influenza nella trachea murina (Figura 3A). A questo scopo, abbiamo isolato i neutrofili PCP+ (92% di purezza; Figura 3B) da CK6-ECFP topi e abbiamo passivamente trasferiti li in un mouse CD11c-YFP infettato con la riossidazione. Dopo di che, abbiamo effett…

Discussion

Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato per la generazione di immagini 4D che mostrano la migrazione dei neutrofili passivamente trasferiti e loro interazioni con DC durante un’infezione influenzale nella trachea del mouse. Il modello descritto 2P-IVM saranno rilevante per studiare la dinamica delle cellule immuni durante un’infezione delle vie aeree.

Recentemente, diversi modelli basati sulla visualizzazione delle dinamiche delle cellule delle vie aeree sono stati sviluppati<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzero (SNF) (176124, 145038 e 148183), l’europeo Commissione Marie Curie per il reinserimento (612742) e il SystemsX.ch una sovvenzione di D.U.P (2013/124).

Materials

Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1X) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20°C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20°C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20°C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

References

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Cite This Article
Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

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