3-b “karaciğer-on-a-chip” enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.
Nerede sadece üç viral genom deneysel olarak enfekte şempanzelerin kronikleşme içinde sonuçlanabilir, olağanüstü infektivite hepatit B virüsü (HBV) içinde vivo rağmen en tüp bebek modelleri birkaç yüz binlerce hücre başına viral genom gerektirir. geçici bir enfeksiyon başlatmak için sipariş. Ayrıca, birincil insan tetkikine (PHH) statik 2D kültürleri sadece kısa vadeli çalışmalar nedeniyle onların hızlı dedifferentiation izin. Burada, biz 3D karaciğer-on-a-chip kültürleri PHH, monocultures veya cocultures ile diğer nonparenchymal karaciğer yerleşik hücre tanımlamak. Bu fizyolojik konak hücre yanıt-e doğru uzun vadeli HBV enfeksiyonlarıdır eğitimi için önemli bir gelişme sunar. İlaç etkinliğini araştırmaları, toksikolojik analiz ve Patogenez soruşturmalar kolaylaştırıcı ek olarak, bu mikrosıvısal kültür sistemleri kovalent kapalı ortadan kaldırarak hedef alan HBV enfeksiyonu için şifalı tedaviler değerlendirilmesi olanaklı kılmak, Daire (ccc) DNA’sı. Bu yöntem PHH monocultures ve PHH/Kupffer hücre ortak kültürleri, saflaştırılmış HBV ile onların enfeksiyon ve ana bilgisayar yanıt analizini up açıklar. Bu yöntem, özellikle uzun vadeli etkileri HBV enfeksiyonu, tedavi kombinasyonları ve Patogenez değerlendirilmesi için geçerlidir.
HBV çalışmanın birkaç yüz binlerce enfeksiyon1başlatmak için hücre başına HBV genomu kopya gerektiren kültür sistemlerinin, zavallı duyarlılık tarafından karmaşık. Ayrıca, birincil insan tetkikine genellikle son derece kırılgan ve hızla geleneksel kültürler2sırasında dedifferentiate. Gerçeğini esas olarak düz ve sert plastik yüzeyler karaciğer ve oksijen yokluğunda mikrosıvısal dolaşım, kültürlerin genel eksikliği içinde bulunan doğal hücre dışı ortamlarda taklit değil nedeni bu. Geleneksel statik hepatosit kültür kolajen kaplı plakalar üzerinde hızla dedifferentiate ve HBV enfeksiyonu3onların duyarlılık kaybetmek. Burada, kurulum ve geleneksel 2B statik PHH kültürler onların genişletilmiş metabolik ve fonksiyonel yetkinlik nedeniyle kolajen kaplı tabaklarda çok avantajlı bitti, 3D karaciğer-on-a-chip kültürler, yetiştirilen PHH enfeksiyonu tarif kolaylaştırılması en az 40 gün4uzun vadeli kültürleri. Bu sistemde, PHH sürekli oksijen ve besin hücrelere sağlamak için büyüme orta ile periosteum kolajen kaplı iskele üzerinde seribaşı. PHH için alternatif kültür sistemleri dayalı olsa bile fare fibroblastlar veya 3D büyüme pulcuklarının karmaşık cocultures doğrulandıktan ve HBV enfeksiyonu ilişkilendirmenin çeşitliliği 500 genom (GE) karşılıkları HBV enfeksiyonu hücre başına, 3D kullanarak yatkındır karaciğer-on-a-chip kültürler kalır tek tüp bebek modeli sistemi 0,05 duyarlı GE HBV hücre4başına. Bu ayrıca HBV enfeksiyonu kurmak için dimetil sülfoksit (DMSO) ve Polietilen glikol (PEG) yüksek konsantrasyonda kullanma gerekliliği tarafından bu kültürlerde 3D karaciğer-on-a-chip kültür sistemleri enfeksiyon için gereksiz olan desteklenen 4. HBV önemli işaretlerinden arasında tüm de üretilen novo–virions5,6için transkripsiyon şablon görevi görür cccDNA havuzu enfeksiyondur. CccDNA geleneksel hepatosit kültürler7,8‘ tespit edilebilir olsa da, ister cccDNA düzenlenmesi ve herhangi bir tedavi yaklaşımları onun eleme amaçlı olarak kısmen recapitulated olarak belirsizdir veya tamamen dediferansiye tetkikine. Biz o cccDNA işlevsel olarak 3D karaciğer-on-a-chip kültürlerde oluşturulur, fizyolojik uyaranlara yanıt verir ve transkripsiyon makine cccDNA genom4erişilebilirliğini engel tarafından hedef göstermiştir.
Bu enfeksiyon, hem de tedavi başarı için biyolojik tanımlaması etkinleştirme, HBV infekte hastaların gözlenen 3D karaciğer-on-a-chip taklit HBV enfeksiyonu için ana bilgisayar yanıt. Karaciğer-on-a-chip kültürlerin benzersiz özellikleri arasında PHH ve karaciğer Kupffer hücreleri4, yildiz seklinde hücre9ve karaciğer sinüsoidal dahil olmak üzere, içindeki diğer nonparenchymal hücreleri arasında uzun vadeli ana bilgisayar yanıt-e doğru değerlendirmek için yeteneğidir endotel hücreleri10,11. Bu karmaşık bir 3D microenvironment etkileşimlerde hücre/hücre değerlendirmek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır.
Ayrıca, bu platform genişletilmiş kültür döneminde geleneksel hepatosit kültür sistemleri kullanarak mümkün olmayan sıralı ilaç tedavileri değerlendirilmesi ve HBV sebat, üzerindeki etkilerini kolaylaştırır.
Bu protokolü nasıl 3D karaciğer-on-a-chip açıklar monocultures, PHH veya PHH cocultures Kupffer hücreleri ile kültürler oluşturulur. Ayrıca, saf HBV enfeksiyonu, düşük çeşitlilik araştırmaları üretimi yanı sıra ev sahibi ve viral yanıt daha sonraki analiz açıklar.
Uzun vadeli PHH kültürleri korumak zorluklar birçok kültür modeli geliştirilmesi artırılmış işlevsellik ve uzun ömürlü, her farklı avantajları ve dezavantajları sergilenmesi ile tahrik. O şimdi 2D kültürleri statik PHH zaman çok sınırlı miktarda hepatosit biyoloji bazı yönlerini taklit eden yaygın kabul edilmektedir. Böylece, micropatterned12,13, küresel kültürler14,15, cocultures ve 3D karaciğer-on-a-chip kültürler16,17 hızla bu daha temel sistemleri değiştirme. Özellikle belirli microenvironments kullanmak için ev sahibi ile coevolved, bulaşıcı hastalıklar, okurken fizyolojik ortamlar sağlamak için gereksinim insan-tropic kültür kez zorlu doğa tarafından desteklenen bulaşıcı hastalıklar, Hepatit C virüsü, HBV ve sıtma gibi.
3D karaciğer-on-a-chip kültürler yerine en kritik kalite başlangıçta kaynaklı birincil hücre tiplerinin adımdır. Bu hücreler-meli var olmak sınav için onların bağlılık kapasitesi ve sadece plateable PHH çok başarılı doku oluşumu ve kültür üretimi sağlamak için kullanılmalıdır. Taze izole PHH kullanılabilir olsa bile, onların dondurma genellikle karmaşık ve özel dondurucular oranı kontrol gerektirir.
Geleneksel statik 2D kültürler, aksine ana bilgisayar genetik arka plan HBV enfeksiyonu duyarlılık açısından ihmal edilebilir düzeydedir ve tüm böylece uzak test hepatosit bağış HBV enfeksiyonu4kurmak mümkün.
Rağmen hasta elde edilen HBV enfeksiyonlar 3D kültürlerin kurar, PEG çöktürülmüş kullanmak zorunludur ve sukroz yastık-HBV indüklenebilir HBV yapımcı hücre kullanarak viral inocula üretimi için hatları her saf. Doğrudan 3D karaciğer-on-a-chip kültürler, inhibitör faktörleri veya tetkikine ile mevcut büyüme faktörlerinin bir uyumsuzluk nedeniyle yoluyla uygulanan hücre kültür supernatants kolayca enfeksiyonu neden değil. Plazma kaçınılmaz pıhtılaşıyor ve kültür platformu mikrosıvısal dolaşımını takunya beri Ayrıca, hasta kaynaklı viral inocula seçerken, yalnızca serum, kullanılmalıdır.
Kullanılan viral inoculum ne olursa olsun, hücresel canlılığı ve farklılaşma temin yanı sıra ilk HBV inoculum tümüyle kaldırılmasını sağlamak başarılı uzun vadeli enfeksiyon çalışmalar anahtarıdır. Bunu yapmak için en uygun yolu viral inoculum kaldırılması aşağıdaki gibi insan serum albümin düzeyleri kültür süresi boyunca ölçme kültürler örnekleme. Dikkat, tüm diğer açıklanan platformlar, HBV enfeksiyonu, benzer şekilde, bir kez kurulan, kolayca kandan hücrelere yayılmış değildir. HBV enfeksiyonu içinde vivo kolayca hepatosit karaciğer içinde çoğunluğu bulaşan beri bunun için altta yatan mekanizma zor kalır.
Açısından cocultures PHH ve Kupffer hücrelerinin tüm ticari olarak mevcut Kupffer hücre bağış eşit bir yanıt beri IL6 ve TNFα salgı LPS stimülasyon, yanıt olarak değerlendirmek için Kupffer hücrelerinin çok testleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
Önemlisi, bütün ilaç tedavileri veya HBV ile kültürlerin ilk enfeksiyon için kuyu (1.4 mL), de mikrosıvısal kanal (0.2 mL), tarihi itibariyle toplam hacmi alınmalıdır dikkate uyuşturucu ya da inoculum konsantrasyonları hesaplanması için. Doğru dozaj sağlamak için mikrosıvısal kanal Başbakan için bir yıkama adım HBV veya uyuşturucu içeren orta ile gerçekleştirilir.
Platformu kullanılan iskele içinde çok katmanlı tetkikine sağlayan şey, başı 600.000 PHH kullanır. Cep numarası farklı olsa bile, seçilen hücre toplama en iyi sonuçları sağlar. Plaka biçimi için 36 iskele yükseltilebilir 12 iskele toplam tutar. Ancak, mikrosıvısal gereksinimleri nedeniyle, daha iyi numaralarına kadar ölçeklendirme bugüne kadar mümkün değildir.
Bu yaklaşımları kullanarak, kültürler, şimdiye kadar yanı sıra yeni ilaç adaylarının değerlendirmek için farklı karaciğer hücre arasındaki karmaşık etkileşim çalışma benzeri görülmemiş fırsatlar sunan en iyi cep performans için en az 40 gün, ile korunabilir nüfus HBV enfeksiyonu sırasında.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Avrupa Araştırma Konseyi (637304), bir hoş geldiniz güven araştırmacı Ödülü (104771/Z/14/Z), başlangıç hibe ve CN Bio yenilikler tarafından finanse edildi.
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |