이 프로토콜의 목표는 B 형 간염 바이러스와 3 차원 “간-온-어-칩” 감염 실험을 수행 하는 단계별 가이드를 제공 하는입니다.
어디 3 바이러스 성 게놈은 실험적으로 감염 된 침팬지의 chronicity에서 발생할 수 있습니다, vivo에서, B 형 간염 바이러스 (HBV)의 뛰어난 infectivity에도 불구 하 고 대부분 체 외 모델 셀 당 바이러스 성 게놈의 수천 수백 필요 일시적인 감염을 시작 하는 순서입니다. 또한, 기본 인간의 hepatocytes (PHH)의 정적 2D 문화 때문에 그들의 급속 한 dedifferentiation 단기 연구만 허용합니다. 여기, 우리가 monocultures 또는 다른 nonparenchymal 간 상주 셀 cocultures PHH의 3D 칩에 간 문화를 설명합니다. 이러한 생리 적인 호스트 세포 응답 장기 HBV 감염을 공부 하 고 상당한 개선을 제공 합니다. 약물 효능 연구, 독물학 분석, 그리고 병 인에 대 한 조사를 촉진, 뿐만 아니라 이러한 미세 문화 시스템 사용 covalently 폐쇄, 제거 목적으로 HBV 감염에 대 한 치료 치료의 평가 원형 (ccc) DNA입니다. 이 방법을 제시 설명 PHH monocultures PHH/Kupffer 세포 공동 문화, 그들의 순화 HBV 감염 및 호스트 응답의 분석 설정을 합니다. 이 방법은 특히 HBV 감염, 치료의 조합, 그리고 병의 장기 효과의 평가에 적용 됩니다.
HBV의 연구 시작 감염1셀당 HBV 게놈 사본의 수천 수백을 요구 하는 문화 시스템의 가난한 민감성에 의해 복잡 하 게 되어 있다. 또한, 기본 인간의 hepatocytes는 일반적으로 매우 약 하 고 빠르게 기존의 문화2동안 dedifferentiate. 이건 평평 하 고 단단한 플라스틱 표면의 자연 extracellular 환경 간 및 미세 순환의 부재에서 문화의 산소의 일반적인 부족 내에서 발견 모방 하지 않습니다는 사실 때문에 주로. 콜라겐 코팅 판에 기존의 정적 hepatocyte 문화는 급속 하 게 dedifferentiate 하 고 HBV 감염3그들의 민감성을 잃게됩니다. 여기, 우리가 설명 설정과 PHH 콜라겐 코팅 판 확장된 그들의 신진 대사와 기능 능력 때문에 기존의 2D 정적 PHH 문화 훨씬 유리한 끝났다, 3D 칩에 간 문화에서 자란의 감염을 촉진 적어도 40 일4의 장기 문화. 이 시스템에서 PHH 지속적으로 세포에 산소와 양분을 공급 성장 매체와 함께 끼얹는다는 콜라겐 코팅 건설 기계에 시드 있습니다. PHH 대안 문화 시스템에 따라 비록 murine 섬유 아 세포 또는 spheroids 3D 성장의 복잡 한 cocultures 검증 된 고 셀, 3D 당 500 게놈 등가물 (GE) HBV의 감염의 복합성을 사용 하 여 HBV 감염에 취약 간 온 칩 문화 유일한 체 외 모델 시스템 0.05에 취약 남아 GE의 HBV 셀4당. 이것은 또한 underpinned 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 높은 농도 사용 하 여 HBV 감염을 확립의 필요성에 의해 이러한 문화에는 3D 칩에 간 문화 시스템의 감염을 위한 불가결 4. HBV의 주요 특징 중 감염 모든 드 노 보–생산 virions5,6transcriptional 템플릿 역할을 하는 cccDNA 풀 이다. 여부 cccDNA의 규칙 및 그것의 제거를 겨냥 하는 어떤 치료 접근은 지에 부분적으로 불분명 남아 비록 cccDNA 기존의 hepatocyte 문화7,8에서 검출 될 수 있다, 또는 완전히 dedifferentiated hepatocytes입니다. 우리는 cccDNA 3D 칩에 간 문화에서 형성 기능, 생리 적 자극에 응답 그리고 transcriptional 기계 cccDNA 게놈4의 접근을 방해 하 여 타겟팅 할 수 있습니다 나타났습니다.
그 관찰 HBV에 감염 된 환자에서 치료 성공으로 감염, 바이오 마커의 식별을 사용 하는 3D 간 온 칩 모방에서 HBV 감염 호스트 응답 합니다. 간 온 칩 문화의 독특한 기능 중 PHH와 Kupffer 세포4, 방사상 세포9및 간 정현파를 포함 하 여 간 내의 다른 nonparenchymal 셀 사이 장기 호스트 응답을 평가 하는 기능이입니다. 내 피 세포10,11. 이 복잡 한 3D microenvironment 상호 작용/셀을 평가 하는 독특한 기회를 제공 합니다.
또한,이 플랫폼의 확장된 문화 기간 용이 불가능 기존의 hepatocyte 문화 시스템을 사용 하 여 순차 약물 치료의 평가 및 HBV 지 속성에 미치는 영향.
이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 3D 간-온-어-칩 PHH의 monocultures 또는 Kupffer 세포 PHH의 cocultures에 대 한 문화 생성 됩니다. 또한, 우리 정화 HBV 감염의 낮은 다중성 연구의 생산 뿐만 아니라 호스트와 바이러스 응답의 후속 분석을 설명합니다.
여러 문화 모델 개발 증가 기능와 장 수, 각 차동 장단점 전시 PHH의 장기 문화를 유지 하는 도전 몰 았다. 그것은 이제 널리 인정 했다 PHH의 정적 2D 문화 매우 제한 된 양의 시간 hepatocyte 생물학의 특정 측면을 흉내내는. 따라서, micropatterned cocultures12,13,15, 회전 타원 체의 문화14,및 3D 칩에 간 문화16,17 빠르게 이러한 기본적인 시스템을 대체 하는. 생리 적인 환경을 제공 하기 위한 요구 사항은 종종 어려운 자연 인간 트로픽 경작의 underpinned 전염 성 질환, 특정 microenvironments를 활용 하는 것 그들의 호스트와 함께 coevolved 있다, 공부 하는 경우에 특히 전염 성 질환, C 형 간염 바이러스, HBV, 말라리아 등.
3D 칩에 간 문화를 수행 하는 가장 중요 한 단계는 처음 공급된 기본 셀 형식의 품질입니다. 이 세포는 그들의 준수 능력에 대 한 테스트 해야 하 고 plateable PHH 많은 성공적인 조직 형성 및 문화 생성을 위해 사용 되어야 한다. 갓 격리 PHH 사용할 수 있습니다, 비록 그들의 cryopreservation는 일반적으로 복잡 하며 특별 한 속도 제어 냉동 고.
기존의 정적 2D 문화, 달리 호스트 유전 배경 민감성 HBV 감염에 관한 무시할 이며 모든 따라서 멀리 테스트 hepatocyte 기증자 HBV 감염4을 설정할 수 있습니다.
환자 파생 HBV 감염 3D 문화의 설정, 그것은 절대적으로 못 시 켰 던 활용 하 고 자당 쿠션-정화 HBV 바이러스 inocula의 생성에 대 한 라인 유도할 수 있는 HBV 프로듀서 셀을 사용 하 여 언제 든 지. 셀 문화 supernatants 3D 칩에 간 문화, hepatocytes와 현재 성장 요인의 호환성 또는 억제 요인의 존재를 통해 직접 적용 쉽게 감염 발생 하지 않습니다. 또한, 선택할 때 환자 파생 바이러스 inocula, 혈 청만 사용 되어야 한다, 때문에 플라즈마 필연적으로 coagulates 문화 플랫폼의 미세 순환을 나 막 신.
바이러스 inoculum 사용에 관계 없이 초기 HBV inoculum의 완전 한 제거를 보장 뿐 아니라 세포 생존 능력 및 차별화, 확신은 성공적인 장기 감염 연구 열쇠 이다. 이렇게 하는 가장 편리한 방법은 문화 바이러스 inoculum의 제거 다음으로 문화 기간 동안 인간 혈 청 알 부 민 수준 측정 샘플링입니다. 노트, 모든 다른 기술된 플랫폼, HBV 감염, 유사 하 게, 않습니다 쉽게 확산 되지 감염 되지 않은 세포에. HBV 감염 vivo에서 쉽게 감염 간 내 hepatocytes의 대부분 이후이 대 한 기본 메커니즘 애매 남아 있습니다.
PHH와 Kupffer 세포의 cocultures에 관해서는 그것은 이후 모든 상용 Kupffer 세포 기증자는 동일한 응답 IL6 및 TNFα 분 비 LPS 자극에 대 한 응답에서을 평가 하 Kupffer 세포의 많은 테스트를 수행 하는 것이 좋습니다.
중요 한 것은, 모든 약물 치료 또는 HBV와 문화의 초기 감염, 우물의 (1.4 mL)도로 미세 채널 (0.2 mL), 총 볼륨 해야 합니다 수 고려 약물 또는 inoculum 농도의 계산에 대 한. 정확한 투약을 보장 하기 위해서 HBV 또는 약물을 포함 하는 매체와 한 세척 단계는 미세 채널 프라임 위해 수행 됩니다.
사용 하는 플랫폼은 건설 기계 내에서 다층된 hepatocytes 보장 잘 당 600000 PHH 활용 합니다. 휴대폰 번호는 변화 될 수 있지만 선택한 셀 농도 최적의 결과 보장 합니다. 플레이트 형식 12 건설 기계, 건설 기계 36에 격상 될 수 있는 총을 보유 하고있다. 그러나, 미세 요구 사항이 높은 잘 번호 확장 불가능 날짜 합니다.
이러한 방법을 사용 하 여, 문화 유지 될 수 있는 최적의 셀 성능을 가진 적어도 40 일 동안,까지, 새로운 약 후보자를 평가 하 고 다른 간 세포 사이 복잡 한 상호 작용을 공부 전례 없는 기회를 제공 HBV 감염 시의 인구
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 유럽 연구 위원회 (637304), Wellcome 신뢰 조사 수상 (104771/Z/14/Z)에서 시 동기 부여에 의해 그리고 CN 바이오 혁신에 의해 투자 되었다.
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |