המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע ניסויים זיהום “כבד-על-שבב” תלת-ממדי עם הנגיף הפטיטיס B.
למרות infectivity יוצא דופן של הנגיף הפטיטיס B (HBV) אין ויוו, שבו רק שלושה הגנום הנגיפי יכול לגרום כרוניות שימפנזות השפעול נגוע, ביותר במבחנה מודלים דורשים כמה מאות אלפי הגנום הנגיפי לכל תא סדר ליזום זיהום ארעית. בנוסף, תרבויות 2D סטטי hepatocytes אנושי ראשוני (PHH) מאפשרים רק לטווח קצר מחקרים עקב dedifferentiation המהירה שלהם. כאן, אנו מתארים 3D תרבויות הכבד-על-שבב של PHH, monocultures או cocultures עם שאר התאים בכבד תושב nonparenchymal. אלה מציעים שיפור משמעותי ללמוד זיהומים HBV לטווח ארוך עם התגובות התא המארח פיזיולוגיים. בנוסף בהנחיה התרופות היעילות לימודי ניתוח רעילות, חקירות פתוגנזה מערכות התרבות microfluidic אלה מאפשרים הערכת טיפולי ריפוי זיהום HBV שמטרתן חיסול covalently סגור, מעגלי (ccc) ה-DNA. זה הציג שיטה מתאר את הסידור של PHH monocultures, PHH/Kupffer תא תרבויות המשנה שלהם זיהום עם HBV מטוהרים, הניתוח של תגובות המארח. שיטה זו ישימה במיוחד על הערכת ההשפעות לטווח ארוך של זיהום, שילובי טיפול פתוגנזה ו HBV.
המחקר של HBV מסובך מאת הרגישות המסכן של מערכות התרבות, הדורשים כמה מאות אלפי עותקים הגנום HBV בכל תא ליזום את זיהום1. יתר על כן, hepatocytes האדם העיקרי בדרך כלל חלשים במיוחד, במהירות dedifferentiate במהלך תרבויות קונבנציונאלי2. זה בעיקר בשל העובדה כי משטחי פלסטיק שטוחה וקשה מחקה את סביבות חוץ-תאית טבעיים המצויים בכבד, חוסר חמצון של התרבויות בהיעדר זרימת microfluidic כללי. תרבויות hepatocyte סטטי המקובלת על צלחות מצופה קולגן במהירות dedifferentiate, מאבדים את הרגישות שלהם ל- HBV זיהום3. כאן, אנו מתארים את הקמה זיהום של PHH גדל בתרבויות הכבד-על-שבב 3D, אשר מהווים יתרון במידה רבה על-קונבנציונאלי 2D סטטי PHH תרבויות על צלחות מצופה קולגן בשל היכולת המורחבת שלהם מטבולית ופונקציונליים, הקלת תרבויות לטווח ארוך לפחות 40 יום4. במערכת זו, PHH הם נזרע על פיגומים מצופים קולגן, אשר הם perfused ללא הרף עם מדיום הגידול לאספקת חמצן וחומרים מזינים לתאים. אף-על-פי תרבות חלופית מערכות PHH מבוסס על cocultures מורכבים fibroblasts מאתר או גידול 3D spheroids יש מאומתים, רגישים לזיהומים HBV באמצעות multiplicities של זיהום במקבילות הגנום 500 (GE) של HBV בכל תא, תלת-ממד כבד-על-שבב תרבויות נשארים במערכת מודל במבחנה הבלעדית רגישים 0.05 ג ‘ נרל אלקטריק של HBV לכל תא4. זה היא בנוסף ביסודה על ידי הצורך באמצעות ריכוז גבוה של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), פוליאתילן גליקול (PEG) להקים HBV זיהום בתרבויות אלה, ובגלל זה לוותר על הזיהום של מערכות התרבות הכבד-על-שבב תלת-ממד 4. בין גולת העיקריים של HBV זיהום הוא מאגר cccDNA, אשר משמש התבנית תעתיק עבור כל de novo–המיוצר virions5,6. אף-על-פי cccDNA ניתן להבחין ב- hepatocyte קונבנציונלי-תרבויות-7,–8, עדיין לא ברור לגבי האם ברגולציה של cccDNA ויש גישות טיפוליות שמטרתן חיסול הם recapitulated ב חלקית או hepatocytes לחלוטין dedifferentiated. אנחנו הראו cccDNA הזה נוצר באופן פונקציונלי בתרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד, מגיב לגירויים פיזיולוגיים, ניתן לפלח על ידי הפרעה את הנגישות של מכונות תעתיק הגנום cccDNA4.
לארח התגובות HBV זיהום ב- 3D לחקות הכבד-על-שבב לאלה הנהוגות HBV נגועים, המאפשר זיהוי סמנים ביולוגיים זיהום, כמו גם ההצלחה הטיפולית. בין התכונות הייחודי של הכבד-על-שבב תרבויות הוא היכולת להעריך תגובות לטווח ארוך מארח בין PHH לבין שאר התאים nonparenchymal בתוך הכבד, כולל תאים4Kupffer, תאי stellate9של הכבד sinusoidal תאי אנדותל10,11. זה מציע הזדמנות ייחודית כדי להעריך את האינטראקציות תא תא microenvironment תלת-ממד מורכבים.
בנוסף, תקופת תרבות מורחב של פלטפורמה זו מקלה על ההערכה של טיפולים בסמים רציפים והשפעתם על התמדה HBV, אשר לא ניתן באמצעות מערכות התרבות hepatocyte קונבנציונלי.
פרוטוקול זה מתאר כיצד 3D הכבד-על-שבב תרבויות נוצרים, עבור monocultures של PHH או עבור cocultures של PHH עם תאים Kupffer. יתר על כן, אנו מתארים את הייצור של HBV מטוהרים ללימודי נמוך-ריבוי-של-זיהום, כמו גם ניתוח עוקבות של המארח ותגובות ויראלי.
האתגרים בשמירה על תרבויות ארוכת טווח של PHH הניעו הפיתוח של מספר מודלים תרבות עם פונקציונליות מוגברת, אריכות ימים, אחד מפגין דיפרנציאלית יתרונות וחסרונות. זה נרחב כעת ידוע כי תרבויות 2D סטטי של PHH הם מחקה היבטים מסוימים של ביולוגיה hepatocyte עבור סכומים מאוד מוגבלת של זמן. לפיכך, micropatterned cocultures12,13,14,תרבויות ספרואיד15, תרבויות הכבד-על-שבב 3D16,17 במהירות החלפת מערכות בסיסי יותר אלו. במיוחד כאשר הלומדים מחלות זיהומיות, אשר יש coevolved עם המנחה שלהם כדי לנצל את microenvironments ספציפיים, הדרישה למתן סביבות פיזיולוגיים היא ביסודה על ידי טיב לעיתים קרובות מאתגרת culturing האדם-חוג מחלות זיהומיות, כולל וירוס הפטיטיס C, HBV ו מלריה.
השלב הקריטי ביותר בביצוע תרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד היא האיכות של סוגי בתחילה מתוצרת התא הראשי. תאים אלה צריך להיבדק על יכולת הדבקות שלהם, רק plateable הרבה PHH אמור לשמש על מנת להבטיח היווצרות רקמת מוצלחת ויצירת תרבות. אף-על-פי PHH מבודדים טרי יכול לשמש, הקפאה קריוגנית שלהם הוא בדרך כלל מורכב ודורש מקפיאים שבשליטת תעריף מיוחד.
בניגוד קונבנציונאלי תרבויות 2D סטטי, הרקע הגנטי של המארח הוא זניח ביחס הרגישות לזיהום HBV, כל התורמים hepatocyte נבדק ובכך-הרחוק הם מסוגלים ליצור זיהום HBV4.
אף-על-פי HBV נגזר המטופל יוצר דלקות של תרבויות 3D, זה הכרחי כדי לנצל זירז פג וטיהרו סוכרוז כרית-HBV בכל פעם באמצעות הסלולרי מפיק HBV inducible קווים לדור של inocula ויראלי. תא supernatants תרבות מוחל ישירות על תרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד, או באמצעות הנוכחות של גורמים מעכבות או עקב חוסר תאימות של גורמי גדילה הנוכחי עם hepatocytes, לא בקלות לגרום זיהום. בנוסף, בעת בחירת המטופל, נגזר inocula ויראלי, רק סרום אמור לשמש, שכן פלזמה באופן בלתי נמנע נקרש שסותם את זרימת הדם microfluidic של פלטפורמת תרבות.
ללא קשר inoculum ויראלי בשימוש, הבטחת הכדאיות הסלולר ובידול, כמו גם להבטיח הסרה מלאה של inoculum הראשונית HBV, הוא המפתח להצלחה בלימודים זיהום לטווח ארוך. הדרך הנוחה ביותר לעשות זאת היא דגימה תרבויות בעקבות הסרת inoculum ויראלי, כמו גם מדידת רמות אלבומין אנושי לאורך כל תקופת תרבות. ראוי לציין, באופן דומה כדי לתאר כל פלטפורמות אחרות, זיהום HBV, הוקמה לאחר, בקלות להתפשט לתאים נגוע. המנגנון הבסיסי זה עודנו מאז HBV זיהום ויוו מדביק ברצון הרוב hepatocytes בתוך הכבד.
לגבי cocultures של תאים PHH ו- Kupffer, מומלץ לבצע בדיקות רבות של תאים Kupffer כדי להעריך את הפרשת IL6 ו TNFα בתגובה לגירוי LPS, מכיוון שלא כל התורמים תא Kupffer זמינים מסחרית של תגובתיות שווה.
חשוב, עבור כל טיפולים תרופות או זיהום ראשוני של תרבויות עם HBV, הנפח הכולל של הבאר (1.4 מ ל), כמו גם החל ערוץ microfluidic (0.2 מ”ל), חייב להילקח בחשבון לחישוב ריכוז סמים או inoculum. על מנת להבטיח מינון מדויק, צעד אחד כביסה בינונית המכיל HBV או סמים זה מבוצע על מנת פריים בערוץ microfluidic.
פלטפורמת בשימוש מנצל PHH 600,000 לכל טוב, המבטיח hepatocytes מרובה שכבות בתוך פיגומים. אף-על-פי מספר תאים יכולים להיות מגוונים, ריכוז התא שבחרת מבטיחה תוצאות אופטימליות. התבנית צלחת מחזיקה סכום כולל של 12 פיגומים, אשר ניתנת לשדרוג פיגומים 36. עם זאת, עקב דרישות microfluidic, אולם שינוי קנה המידה למספרים גבוהים יותר טוב. בלתי אפשרי לצאת
באמצעות גישות אלה, תרבויות יכול להישמר עם ביצועים מיטביים תא לפחות 40 ימים, אשר, עד כה, מציע הזדמנויות חסר תקדים כדי להעריך את הרומן סמים המועמדים, כמו גם ללמוד הגומלין המורכבים בין תאים שונים הכבד אוכלוסיות במהלך זיהום HBV.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומן על ידי מענק Starter של המועצה האירופית למחקר (637304), Wellcome אמון החוקר פרס (104771/ת/14-Z), ועל ידי CN ביו חידושים.
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |