Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d “Leber-on-a-Chip” Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.
Trotz der außergewöhnlichen Infektiosität des Hepatitis B-Virus (HBV) in-vivo, wo nur drei virale Genom einer Chronifizierung von experimentell infizierten Schimpansen führen kann, erfordern die meisten in-vitro-Modelle mehrere Hunderte bis Tausende von viraler Genome pro Zelle in Bestellung um eine transiente Infektion zu initiieren. Darüber hinaus können statische 2D Kulturen von primären humanen Hepatozyten (PHH) nur Kurzzeitstudien aufgrund ihrer schnellen Entdifferenzierung. Hier beschreiben wir 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen der PHH, Monokulturen oder in Kokulturen mit anderen Nonparenchymal-Leber-Resident-Zellen. Diese bieten eine deutliche Verbesserung zu langfristigen HBV-Infektionen mit physiologischen Host-Zell-Reaktionen zu studieren. Neben der Vermittlung Medikament Wirksamkeitsstudien, toxikologische Analyse und Untersuchung der Pathogenese, ermöglichen diese mikrofluidische Systeme die Bewertung der kurativen Therapien für HBV-Infektion zur Beseitigung kovalent geschlossen, Rundschreiben (ccc) DNA. Diese Methode vorgestellt beschreibt den Aufbau von PHH Monokulturen und PHH/Kupffer Zelle Ko-Kulturen, ihre Infektion mit gereinigtem HBV und die Analyse von Host-Antworten. Diese Methode ist insbesondere für die Bewertung der langfristigen Auswirkungen der HBV-Infektion Behandlungskombinationen und Pathogenese.
Das Studium der HBV hat durch die schlechte Anfälligkeit der Kultur-Systeme erfordern mehrere Hunderte bis Tausende von HBV-Genom-Kopien pro Zelle, die Infektion1zu initiieren erschwert. Darüber hinaus primären humanen Hepatozyten sind in der Regel außerordentlich empfindlich und schnell während konventionelle Kulturen2Gewebestammzelle. Dies ist hauptsächlich auf der Tatsache, dass die flachen und harten Kunststoffoberflächen nicht die extrazellulären Naturlandschaften gefunden innerhalb der Leber und des allgemeinen Mangels an Sauerstoffversorgung der Kulturen in der Abwesenheit von mikrofluidischen Zirkulation imitieren. Herkömmlichen statischen Hepatozyten Kulturen auf Kollagen-beschichteten Platten schnell Gewebestammzelle und verlieren ihre Anfälligkeit für HBV-Infektion3. Hier beschreiben wir die Einrichtung und die Infektion der PHH gewachsen in 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen, die über herkömmliche 2D statischen PHH Kulturen auf Kollagen-beschichteten Platten aufgrund ihrer längeren Stoffwechsel- und funktionale Kompetenz enorm vorteilhaft sind, erleichtern langfristige Kulturen von mindestens 40 Tage4. In diesem System sind PHH auf Kollagen-beschichtete Gerüste, die ständig mit Wachstumsmedium, Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen liefern durchblutet werden ausgesät. Obwohl Alternativkultur Systeme für PHH basiert auf komplexen Kokulturen murine Fibroblasten oder 3D Zunahme der Sphäroide wurden validiert und sind anfällig für HBV-Infektion mit Mannigfaltigkeiten der Infektion von 500 Genom-Äquivalente (GE) von HBV pro Zelle, 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen bleiben das alleinige in-vitro-Modellsystem anfällig für 0,05 GE des HBV pro Zelle4. Dies wird zusätzlich durch die Notwendigkeit der Verwendung von hoher Konzentrationen von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Polyethylenglykol (PEG), um HBV-Infektion zu etablieren in diesen Kulturen untermauert ist entbehrlich für die Infektion von 3D Culture Leber-on-a-Chip-Systeme 4. unter die wichtigsten Kennzeichen der HBV-Infektion ist der CccDNA Pool, fungiert als die transkriptionelle Vorlage für alle de Novo–produzierte Virionen5,6. Obwohl CccDNA in konventionellen Hepatozyten Kulturen7,8festgestellt werden kann, bleibt es unklar, ob die Regelung der CccDNA und jede therapeutische Ansätze, die darauf abzielen, ihre Beseitigung in teilweise zusammengefasst sind oder komplett entdifferenzierten Hepatozyten. Wir haben gezeigt, dass CccDNA funktional in 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen gebildet wird, auf physiologische Reize reagiert und kann durch Eingriffe in die Zugänglichkeit der transkriptionellen Maschinen CccDNA Genom4ausgerichtet sein.
Host-Antworten auf HBV-Infektion in 3D Leber-on-a-Chip-Mimic diejenigen bei HBV-infizierten Patienten, ermöglicht die Identifizierung von Biomarkern für Infektion sowie Therapieerfolg beobachtet. Zu den einzigartigen Funktionen des Leber-on-a-Chip-Kulturen ist die Fähigkeit, langfristige Host Antworten zwischen PHH und anderen Nonparenchymal Zellen in der Leber, einschließlich Kupffer Zellen4Ganglion Zellen9und Leber sinusförmigen bewerten Endothelzellen10,11. Dies bietet die einmalige Gelegenheit, Zell/Zell-Interaktionen in einem komplexen 3D Mikroumgebung zu bewerten.
Darüber hinaus erleichtert die erweiterte Kulturdauer dieser Plattform die Bewertung der sequentiellen medikamentöse Behandlungen und deren Auswirkungen auf HBV Beharrlichkeit, die nicht mit herkömmlichen Hepatozyten-Kultur-Systeme möglich sind.
Dieses Protokoll beschreibt wie 3D Leber-on-a-Chip Kulturen entstehen, für Monokulturen PHH oder Kokulturen PHH mit Kupffer Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir die Herstellung von gereinigtem HBV für niedrige Multiplizität der Infektion Studien sowie die anschließende Analyse von Host und virale Antworten.
Die Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der langfristigen Kulturen der PHH haben die Entwicklung der verschiedenen Kultur-Modelle mit erhöhter Funktionalität und Langlebigkeit, jeweils ausstellenden differenzierte vor- und Nachteile vorangetrieben. Es ist jetzt weithin anerkannt, dass statische 2D Kulturen der PHH bestimmte Aspekte der Hepatozyten Biologie für sehr begrenzte Zeit imitiert werden. So Micropatterned cocultures12,13, Sphäroid Kulturen14,15, und 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen16,17 sind diese grundlegenden Systeme ersetzen. Vor allem bei Infektionskrankheiten, die mit ihrem Wirt zu bestimmte Mikroumgebungen nutzen Weiters haben studieren, ist die Voraussetzung für die Bereitstellung von physiologischen Umgebungen durch die oft anspruchsvollen Art der Kultivierung menschlichen-Tropic untermauert. Infektionskrankheiten, einschließlich Hepatitis-C-Viren, HBV und Malaria.
Der wichtigste Schritt bei der Durchführung von 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen ist die Qualität der ursprünglich aus der Region Primärzelle Typen. Diese Zellen sollten für ihre Einhaltung Kapazität getestet und nur plateable PHH viele sollte verwendet werden, um erfolgreiche Gewebebildung und Kultur-Generation zu gewährleisten. Obwohl frisch isolierte PHH verwendet werden kann, ihre Kryokonservierung ist in der Regel kompliziert und erfordert spezielle Rate gesteuert Gefriergeräte.
Im Gegensatz zu herkömmlichen statischen 2D Kulturen Host genetischen Hintergrund ist in Bezug auf Anfälligkeit für HBV-Infektion vernachlässigbar, und alle-bisher getesteten Hepatozyten Spender sind HBV-Infektion4herstellen.
Obwohl Patienten abgeleitet HBV-Infektionen des 3D Kulturen herstellt, ist es unerlässlich, PEG-ausgefällt zu nutzen und Saccharose Kissen-gereinigte HBV wann immer mit induzierbaren HBV-Produzent-Zelle für die Generation der viralen Impfkulturen Zeilen. Zelle Kultur Überstände direkt angewendet, 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen, sei es durch das Vorhandensein von hemmenden Faktoren oder aufgrund einer Inkompatibilität des vorliegenden Wachstumsfaktoren mit Hepatozyten, führen nicht ohne weiteres Infektion. Darüber hinaus sollte bei der Auswahl der Patienten abgeleiteten viraler Impfkulturen nur Serum verwendet werden, da Plasma unweigerlich gerinnt und die mikrofluidischen Zirkulation der Kultur-Plattform verstopft.
Unabhängig von der viralen Inokulum verwendet ist zelluläre Lebensfähigkeit und Differenzierung zu gewährleisten, sowie eine vollständige Entfernung des ersten HBV Inokulums Schlüssel zum erfolgreichen Infektion Langzeitstudien. Der bequemste Weg, dies zu tun ist nach der Beseitigung der viralen Inokulums sowie die Messung der menschlichen Serum-Albumin Niveaus während der gesamten Kultur Kulturen Probenahme. Der Hinweis, ähnlich wie bei allen anderen beschriebenen Plattformen, HBV-Infektion, einmal etabliert, verbreiten nicht ohne weiteres auf nicht infizierten Zellen. Der zugrunde liegende Mechanismus dafür bleibt schwer fassbar, da HBV-Infektion in-vivo bereitwillig den Großteil der Hepatozyten in der Leber infiziert.
In Bezug auf Kokulturen PHH und Kupffer Zellen ist es ratsam, viel Tests von Kupffer Zellen, IL6 und TNF-Sekretion in Reaktion auf die LPS Stimulation zu bewerten, da nicht alle im Handel erhältlichen Kupffer Zelle Spender eine gleiche Reaktionsfähigkeit haben durchführen.
Wichtig ist, für alle medikamentöse Behandlungen oder erste Kulturen mit HBV-Infektion, muss das Gesamtvolumen des Brunnens (1,4 mL), sowie ab der Mikrofluidik-Kanal (0,2 mL), berücksichtigt werden bei der Berechnung der Droge oder Inoculum Konzentrationen. Um eine genaue Dosierung zu gewährleisten, wird ein Waschschritt mit HBV oder Drogen-haltigem Medium durchgeführt, um den Kanal mikrofluidischen prime.
Die verwendeten Plattform nutzt 600.000 PHH pro Bohrloch, die vielschichtige Hepatozyten innerhalb der Gerüste gewährleistet. Obwohl die Anzahl von Zellen variiert werden kann, sorgt für die gewählten Zellkonzentration optimale Ergebnisse. Das Plattenformat hält insgesamt 12 Gerüste, die zu 36 Gerüste erweitert werden kann. Ist jedoch aufgrund der mikrofluidischen Anforderungen skalieren zu höheren gut Zahlen nicht möglich bis heute.
Mit diesen Ansätzen können Kulturen mit optimalen Zellleistung mindestens 40 Tage lang gepflegt werden bietet, bisher nie da gewesene Möglichkeiten, neuartige Medikamenten-Kandidaten zu bewerten, als auch das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen hepatischen Zellen zu studieren Populationen während der HBV-Infektion.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von einem Starter Stipendium des European Research Council (637304), ein Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), und CN Bio Innovationen finanziert.
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |