このプロトコルの目標は、B 型肝炎ウイルスと 3-D「肝臓-オン-チップ」感染実験を実行するステップ バイ ステップ ガイドを提供することです。
にもかかわらず、実験感染したチンパンジーの慢性、唯一の 3 つのウイルスのゲノムを使用することが、生体内で、B 型肝炎ウイルス (HBV) の例外的な感染性の in vitro モデル最も必要でセルごとのウイルスのゲノムの数千に数百一過性感染を開始する順序。また、ひと肝細胞 (PHH) 静的 2D 文化は彼らの急速な脱分化による短期的な研究のみを許可します。ここでは、モノカルチャーまたは他の実質の肝臓居住者細胞と共培養系、PHH の 3 D の肝臓オンチップ文化について述べる。これらは生理的ホスト細胞応答と長期的な HBV 感染症の勉強に重要な改善を提供しています。薬剤の有効性の研究、毒性学的分析、および病因の捜査を促進する、に加えてこれらマイクロ培養装置は、HBV 感染した閉鎖を排除することを目的とした根治的治療法の評価を有効にします。円形 (ccc) DNA。これはメソッドが提示は PHH モノカルチャー ・ PHH/クッパー細胞共培養、精製の HBV の感染宿主反応の解析の設定について説明します。このメソッドは、特に HBV 感染、治療の組み合わせと病因の長期的影響の評価に適用されます。
B 型肝炎ウイルスの研究開始感染1セルあたり HBV ゲノム コピーの数千に数百を必要とする文化システムの感受性に乏しいによって複雑にされています。また、ひと肝細胞は一般に非常に壊れやすい、従来の文化2の間に急速に脱分化します。これは、平坦で、ハード プラスチックの表面は肝臓とマイクロ流体循環の不在で文化の酸素化の一般的な欠如内で見つかった自然細胞環境を模倣しないという事実が主に原因です。コラーゲン被覆板に従来の静的な肝細胞培養は急速に脱分化し、HBV 感染3感受性を失います。ここでは、セットアップと拡張機能的な代謝能力によりコラーゲン被覆板従来 2次元静的 PHH 文化非常に有利であるが、3 D の肝臓オンチップ文化で育った PHH の感染について述べる促進少なくとも 40 日間4の長期的な文化。このシステムは、PHH は細胞に酸素と栄養を供給する培地で継続的に潅流されたコラーゲン被覆の足場にシードされます。マウス線維芽細胞または回転楕円体の 3 D の成長の複雑な共培養系が検証され、セル、3 D あたり 500 ゲノム相当 (GE) HBV の感染を使用して HBV 感染に敏感であるにもかかわらず PHH の代替文化システムに基づいて肝臓オンチップ文化 0.05 を受けやすい唯一の in vitro モデル システムのまま HBV GE セル4あたり。これまたにより支えられています HBV 感染を確立し高濃度のジメチルスルホキシド (DMSO) とポリエチレング リコール (PEG) を使用しての必要性これらの文化で 3 D の肝臓オンチップ培養システムの感染症のため不可欠であるであります。4します。 b 型肝炎ウイルスの主な特徴の一つ感染症は cccDNA プールは、de novo–生成粒子5,6の転写のテンプレートとして機能します。CccDNA は、従来肝細胞文化7,8で検出することができます、にもかかわらずかどうか cccDNA の規制とその除去を目指した治療上のアプローチは、要約で部分的に不明のままか完全に脱分化型肝細胞。私たちはその cccDNA 3 D チップ上の肝臓文化で形作られる機能的生理学的刺激に応答する、cccDNA ゲノム4転写マシナリーのアクセシビリティとの干渉によってターゲットすることができますを示しています。
HBV 感染患者、治療成功と同様、感染症のためのバイオ マーカーの同定を有効にすることで 3 D の肝臓オンチップ模倣 HBV 感染への応答をホストします。肝臓にチップ文化のユニークな機能の中では PHH とクッパー細胞4、星状細胞9、正弦波の肝など肝臓内の他の実質細胞の長期のホスト応答を評価する能力内皮細胞10,11。これは、複雑な 3次元微小環境におけるセル/セル相互作用を評価するユニークな機会を提供しています。
さらに、このプラットフォームの拡張の培養期間は従来肝細胞培養システムでは不可能な連続的な薬物治療の評価および HBV の持続性に与える影響を促進します。
このプロトコルを記述する方法 3 D 肝臓-オン-チップ PHH のモノカルチャーのためまたは PHH のクッパー細胞と共培養系の文化が生成されます。さらに、ホストとウイルスの応答の後の分析と同様、低感染多様性研究、浄化された HBV の生産について述べる。
PHH の長期的な文化を維持する上での課題は機能の向上と長寿、差分の長所と短所を示す各いくつかの培養モデルの開発を追い出しました。それは今広く認められる PHH の静的 2D 文化が時間の非常に限られた量の肝細胞生物学の特定の側面が模倣されます。したがって、マイクロパターニングゲル cocultures12,13, 回転楕円体文化14,153 D チップ上の肝臓文化16,17は急速にこれらのもっと基本的なシステムを交換します。生理学的な環境を提供するための要件が養殖人間熱帯の頻繁に挑戦的な性質により支えられていますがキノコアリにおける特定の微小を活用する彼らのホストである感染症を勉強して場合は特にC 型肝炎ウイルス、b 型肝炎、マラリアなどの感染症。
3 D の肝臓オンチップ文化を実行する最も重要なステップは、最初に供給された一次電池型の品質です。これらの細胞の遵守能力を試される、成功組織形成と文化の世代を確保するために plateable PHH たくさんのみを使用する必要があります。新鮮単離 PHH を使用ことができます、にもかかわらず、凍結保存は通常複雑であり特別なレート制御の冷凍機が必要です。
従来の静的 2D 文化と対照をなしてホストの遺伝的背景は HBV 感染の感受性に関して無視しすべてここまでテストされた肝細胞ドナーが b 型肝炎ウイルス感染4を確立すること。
にもかかわらず、患者由来 b 型肝炎ウイルスは、3 D 文化の感染を確立、PEG 沈殿を活用することが不可欠だし、ショ糖クッション精製 HBV ウイルス接種の世代線誘導性 HBV プロデューサー セルを使用するたびに。3 D チップ上の肝臓文化のいずれかを介して抑制的な要因または存在の成長因子、肝細胞との互換性がないのための存在に直接適用される細胞培養上清は、感染症で容易に起因しません。また、患者由来のウイルス接種を選択すると、血清のみを使用するのでプラズマは必然的に凝固して文化のプラットフォームのマイクロ流体循環の下駄します。
使用ウイルス菌に関係なく初期の b 型肝炎接種菌の完全な除去を保障し同様、細胞と分化、確保成功した長期的な感染症研究鍵です。これを行う最も便利な方法は、培養期間中のひと血清アルブミン レベルの測定し同様、接種ウイルスの除去に続いて文化をサンプリングです。ノートでは、すべての他の記載されているプラットフォーム、HBV 感染と同様の確立されると、容易に広がっていない、感染していない細胞。この基になるメカニズムは、HBV 感染生体内で容易に感染、肝臓内の肝細胞の大半以来とらえどころのないまま。
PHH とクッパー細胞の共培養系、に関して、すべて市販クッパー細胞の提供者と同じ応答を持っているので、LPS 刺激による、IL6 と tnf α の分泌を評価するクッパー細胞の多くのテストを実行することをお勧めします。
重要なは、すべて薬物治療または HBV に文化の初期感染は、井戸 (1.4 mL) もマイクロ流路 (0.2 mL)、現在の合計量する必要があります考慮する薬物または接種濃度の計算のため。正確な投与を保証するためにマイクロ流路を総理するために b 型肝炎ウイルスや薬物を含む培地で 1 つの洗浄のステップが実行されます。
使用しているプラットフォームにより、足場内多層肝細胞もあたり 600,000 PHH を利用しています。にもかかわらず、セル数を変えることができます、選択したセルの濃度は最適な結果を保証します。版のフォーマットは、36 の足場にアップグレードすることができます 12 足場の合計を保持します。ただし、マイクロ流体の要件によりよく数字が大きいほどにスケール アップは不可能までです。
これらのアプローチを使用して、文化はこれまで異なる肝細胞間の複雑な相互作用の研究し同様、新しい薬剤の候補者を評価する前例のない機会を提供する、少なくとも 40 日間最適な電池の性能を維持できHBV 感染集団。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、CN バイオ技術革新、欧州研究会議 (637304)、Wellcome の信頼賞 (104771/Z/14/Z) からスターターの補助金によって賄われていた。
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |