HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

Summary

이 프로토콜 신생아 NSG 쥐 방사선 조절로 인간 조 혈 줄기 세포의 intrahepatic 주입을 통해 humanized 쥐 (hu-NSG)를 설정 하는 방법을 제공 합니다. Hu NSG 마우스 HIV 감염 및 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 취약 하 고 HIV 복제 및 대기 시간 조사에 대 한 적합 한 병 태 생리 모델 역할.

Abstract

윤리 규정 및 인간의 병 리, 면역학, 및 치료 개발 연구를 위한 기술 과제 수요에 작은 동물 모델에 놓여 있다. 인 간에 게 가까운 유전과 행동 닮았다, 마우스 같은 작은 동물 인간 질병 모델을 통해 인간과 같은 증상 및 응답은 지 수 수에 대 한 좋은 후보 있습니다. 또한, 마우스 유전 배경 다양 한 요구에 맞게 변경할 수 있습니다. 끄 덕/SCID/IL2rγ^null (NSG) 마우스는 가장 널리 사용 되 immunocompromised 마우스 긴장; 인간 조 혈 줄기 세포 및 인간 조직 및 기능 인간의 면역 시스템의 후속 개발 engraftment를 수 있습니다. 이 예 지 및 HIV/에이즈 등 인간의 특정 질병의 병 태 생리학을 이해 하 고 치료에 대 한 검색을 원조에 중요 한 이정표 이다. 여기, 우리는 조 혈 줄기 세포 이식 방사선 조절 신생아 NSG 마우스에 의해 humanized NSG 마우스 모델 (hu-NSG)를 생성 하기 위한 상세한 프로토콜을 보고 합니다. Hu-NSG 마우스 모델 이식된 인간 줄기 세포의 hiv-1 바이러스 감염 민감성 멀티 리니지 개발을 보여줍니다. 그것은 또한 주요 생물 학적 특성 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 대 한 응답을.

Introduction

인간의 질병에 대 한 적절 한 동물 모델을 확립 치료법을 찾는 열쇠입니다, 때문에 적절 한 동물 모델 오래 되었습니다 추구 있고 시간이 지나면서 개선. Immunocompromised murine 모델의 여러 변종 인간 세포 및 조직의 engraftment 및 인간 답게 된 기능^1,2의 후속 실행을 허용 하는 개발 되었습니다. 이러한 인간 답게 마우스 모델은 인간의 특정 질병^3,,45의 수사를 위해 중요 합니다.

후천성 면역 결핍 증후군 (에이즈) 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염에서 발생 한 예입니다. 인간 답게 마우스 모델의 설립 이전에 윤리적, 기술적 한계 국한 HIV/에이즈 비 인간 영장류³전 임상 동물 연구. 그러나, 높은 비용 및 이러한 동물에 대 한 전문적인된 치료에 대 한 요구 사항을 일반적인 학술 설정에서 HIV/에이즈 연구를 방해. 에이즈는 주로 인간의 CD4 + T 세포를 감염 및 개발 및 B 세포, 대 식 세포, 수지상 세포⁶; 등 다른 인간의 면역 세포의 면역 반응에 미치는 영향 따라서, 기능 인간의 면역 시스템으로 이식 하는 작은 동물 모델 높은 수요에 있습니다.

돌파구는 1988 년에 때 Prkdc^scid 돌연변이와 CB17-scid 쥐 개발 되었고 인간의 면역 시스템¹의 성공적인 engraftment를 보여 왔다. 결함이 T-와 B-세포 기능에 Prkdc^scid 돌연변이 결과 쥐에 연기나 적응 면역 체계, 단 세포 (PBMCs), 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 혈액의 인간의 주변 engraftment 하도록 하 고 태아의 조 혈 조직^7,8. 그럼에도 불구 하 고, engraftment의 저급은 자주 관찰이 모델; 가능한 원인은 자연 킬러 (NK)를 통해 변조 1) 잔여 타고 난 면역 활동-세포와 마우스 T와 B 세포 (시키는)⁵의 2) 단계의 개발. 비만 아닌 당뇨병 (끄 덕)의 후속 개발-scid 마우스 모델 달성 극적인 다운 레 귤 레이 션의 NK 세포 활동; 따라서, 그것은 높은 수준과 인간의 면역 체계 구성 요소⁹의 더 많은 지속 가능한 engraftment를 지원할 수 있습니다. 더 억제 또는 마우스 모델 베어링 잘림 또는 interleukin-2 수용 체 γ-체인 (Il2rg)의 총 녹아웃 (끄 덕)에서 타고 난 면제의 발전을 방해-scid 배경 설치 되었다. Il2rg, 일컬어 일반적인 cytokine 수용 체 γ-체인, 다양 한 cytokine 수용 체^10,11,,1213의 필수적인 구성 요소입니다. 끄 덕 같은 변종. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wji (NSG)와 NODShi.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Sug (노 그)에서 마우스 cytokine 신호의 강력한 중단 및 NK 세포 개발의 완전 한 절제를 제시 적응 면역^14,,1516의 심한 장애 뿐만 아니라.

3 인간 답게 마우스 모델 베어링 scid 돌연변이 및 Il2rg 녹아웃 자주 HIV/에이즈 연구에서 채택 된다: 샌드위치 (골/간/Thymus) 모델, PBL (주변 혈액 백혈구) 모델 및 SRC (SCID 다시 채우기 셀) 모델 ³.는 샌드위치 모델 인간 태아 간, 태아 간 HSCs^3,,1718의 정 맥 주사와 함께 마우스 신장 캡슐 아래 thymus의 외과 이식 통해 만들어집니다. 높은 engraftment 효능, 모든 계보에서 인간 조 혈 모 세포의 개발 및 강한 인간의 면역 시스템;의 설립을 제공 하는 샌드위치 마우스 모델 또한, T-세포는 인간의 헌 thymus에서 교육 하 고 면역 응답 HLA 제한^4,5,,1719전시. 그러나, 수술 절차에 대 한 요구 사항은 샌드위치 모델의 주요 단점은 남아 있습니다. PBL 마우스 모델 인간의 주변 림프 세포를 정 맥 주사에 의해 설정 됩니다. PBL 모델 편의 제공 하 고 성공적인 T-셀 engraftment를 생성 하지만 응용 프로그램은 부족 한 B-세포 및 골수성 세포 engraftment, 낮은 engraftment 수준 전체, 그리고 심한 이식-비교-호스트 질병 (GVHD)^{3의 발병으로 인해 제한 ,20}. SRC 마우스 모델 신생아 또는 젊은 성인 SCID 쥐로 인간의 HSCs의 주사를 통해 설정 됩니다. 그것은 (말 초 혈액 CD45 비율으로 평가) 25% 이상 평균 engraftment 효율성을 전시 하 고 주입된 HSCs의 다중 계보 개발 및 타고 난 인간의 면역 시스템의 퇴 고를 지원 합니다. 그러나, SRC 모델의 한계가 이다 T 세포 응답 인간의 HLA 제한^14,21대신 H2 제한 마우스입니다.

SRC 마우스 모델 연구를 위한 전 임상 HIV/에이즈 작은 동물, 인간의 면역 체계와 성공적인 조 혈 개발의 일관성 engraftment exemplified 손쉬운 고 안정적인 모델을 간주 됩니다. 우리는 이전 보고 NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) 마우스 모델의 설립 하 고 HIV 복제 및 대기 연구^22,,2324그것의 응용 프로그램을 설명. 이 hu NSG 마우스 모델 골 유도, HIV에 감염 자화 율의 높은 수준 및 HIV 감염의 병 인 재현 부를 전시 한다. 또한, hu NSG 마우스 모델 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 적절 하 게 응답 하 고 카트 철수, 확인 된 에이즈 대기 저수지^{25,26의 설립에 따라 플라즈마 바이러스 리바운드를이 ,27}. 이 HIV 대기 저수지는 인간의 휴식 하는 CD4 + T 세포 감염 및 카트 취급 hu NSG 쥐에서 분리에 의해 유도 된 복제 유능한 HIV 바이러스 전 비보 의 생산에 의해 더 입증 된다.

여기, 우리 대기 시간 개발에 대 한 HIV 감염 및 카트 치료에 관련 된 절차를 포함 하 여 신생아 NSG 쥐에서 hu NSG 마우스 모델의 설립에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 새로운 HIV 에이즈 바이러스학, 대기 시간 및 치료에 관한 동물 연구에 접근을 제공 하는이 프로토콜을 기대 합니다.

Protocol

모든 동물 보호 및 절차 프로토콜 검토 및 승인 하 여 시의 희망 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 개최 (닥터 존으로 시, IACUC #12034)이이 연구의 책임자에 의해 수행 되었습니다. 인간 태아 간 조직 비영리 단체, 연방 및 주 규정에 따라 고급 생명 자원 (Alameda, CA)에서 얻은 했다. 공급 업체 자체 기관 검토 위원회 (IRB) 및 인간 주제 보호 요구 사항을 준수. 인간의 PBMCs 나이, 인종, 성별, 또는 민족?…

Representative Results

교류 cytometry 분석은 자주 고립된 HSCs의 순도 확인, 평가 하 engraftment 수준, 프로필 면역 반응에 바이러스 성 감염, 고 카트 효능을 조사 수행 됩니다. 일반적인 항 체 패널 포함 4-6 개인 붙일 레이블된 항 체; 따라서, 다양 한 필터와 여러 레이저 교류 cytometer은 정확한 결과 달성 하기 위한 중요 합니다. 초기 engraftment 유효성 검사?…

Discussion

인간의 세포/조직으로 engrafted immunocompromised 쥐 인간과 같은 생리 적 특성을 제시 하 고 인간의 특정 질병에 관한 병 리, 병 태 생리학, 및 면역학 연구에 대 한 엄청난 가치. 가운데 immunocompromised 쥐, 끄 덕의 여러 변종. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wji (NSG) 모델은 가장 타고 난과 적응 면역,^{3,12,19 신호 연기나 마우스 관련 cyt…}

Materials

CD34 MicroBead Kit, human	MiltenyiBiotec	130-046-703
CryoStor CS2	Stemcell Technologies	07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji	The Jackson Laboratory	005557	Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo	Patterson Veterinary	07-806-3204	Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant	Fisher Sicentific	NC9189926
Wescodyne	Fisher Sicentific	19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle	Hamilton	80508	Custom made
Blood collection tube (K2EDTA)	BD Bioscience	367843
Blood collection tube (Heparin)	BD Bioscience	365965
Capillary tube (Heparinized)	Fisher Sicentific	22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer	Sigma Aldrich	11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit	Qiagen	52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix	Thermofisher	4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)	PerkinElmer	NEK050B001KT
IgG from human serum	Sigma Aldrich	I4506-100MG
IgG from mouse serum	Sigma Aldrich	I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)	BD Biosciences	564586	RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)	BD Biosciences	557851	RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)	BD Biosciences	558116	RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)	BD Biosciences	563795	RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)	ThermoFisher	MHCD1427	RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)	ThermoFisher	MHCD1904	RRID: AB_10373382, LOT 1725304B