JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

人性化的 nod/scid/il2γ空 (hu-nsg) 小鼠 hiv 复制和延迟研究模型

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

该方案提供了一种方法, 建立人性化小鼠 (hu-nsg) 通过肝内注射人类造血干细胞到辐射条件下的新生儿 nsg 小鼠。hu-nsg 小鼠容易感染 hiv 感染和组合抗逆转录病毒疗法 (cart), 是治疗艾滋病毒复制和潜伏期调查的合适病理生理模型。

Abstract

人类病理学、免疫学和治疗发展研究的伦理法规和技术挑战, 对小动物模型的需求很高。与人类有着密切的遗传和行为相似, 像老鼠这样的小动物是人类疾病模型的理想选择, 通过这些模型可以重述类似人类的症状和反应。此外, 可以改变小鼠的遗传背景, 以适应不同的需求。nod/scid/il2rγ null (nsg) 小鼠是应用最广泛的免疫功能低下小鼠菌株之一;它允许植入与人类造血干细胞和/或人体组织和随后的功能性人类免疫系统的发展。这是了解艾滋病毒/艾滋病等人类特有疾病的预后和病理生理学以及帮助寻找治愈方法的一个重要里程碑。在此, 我们报告了一个详细的方案, 以产生人性化的 nsg 小鼠模型 (hu-nsg) 造血干细胞移植到辐射条件下的新生儿 nsg 小鼠。hu-nsg 小鼠模型显示了移植的人的干细胞的多谱系发展和对 hiv-1 病毒感染的易感性。它还概述了与组合抗逆转录病毒疗法 (cart) 相响应的关键生物学特征。

Introduction

由于建立适合人类疾病的动物模型是找到治愈方法的关键, 随着时间的推移, 适当的动物模型早已得到追求和改进。已经开发出多种免疫功能低下的小鼠模型, 允许人体细胞和组织的雕刻, 并随后执行人性化的功能1,2。这种人性化的小鼠模型对于研究人类特有的疾病3、4、5至关重要。

因感染人体免疫机能丧失病毒 (hiv) 而引起的获得性免疫缺陷综合症 (aids) 就是一个例子。在建立人性化的小鼠模型之前, 伦理和技术限制将艾滋病毒/艾滋病临床前动物研究局限于非人类灵长类动物3。然而, 对这种动物进行专门护理的高昂费用和要求阻碍了典型学术环境中的艾滋病毒/艾滋病研究。hiv 主要感染人类 cd4 + t 细胞, 并影响其他人类免疫细胞的发育和免疫反应, 如 b 细胞、巨噬细胞和树突状细胞6;因此, 对移植功能人体免疫系统的小动物模型的需求很大。

1988年取得了突破, 当时 cb17-科学小鼠与 prkdc科学突变的开发, 并显示出成功的人类免疫系统1的雕刻。prkdc科学突变导致小鼠 t 细胞和 b 细胞功能缺陷和消融的适应性免疫系统, 从而能够植入人外周血单个核细胞 (pbmc)、造血干细胞 (hsc) 和胎儿造血组织7,8。尽管如此, 在这种模式中经常观察到低水平的雕刻;可能的原因是 1) 残留的先天免疫活性通过自然杀手 (nk) 细胞调制和 2) 小鼠 t-和 b 细胞 (泄漏)的后期发育。非肥胖糖尿病 (nod)-科学小鼠模型的后续发展实现了 nk 细胞活性的显著降低;因此, 它能够支持更高层次和更可持续的人类免疫系统组成部分9的雕刻。为了进一步抑制或阻碍先天免疫的发展, 建立了小鼠模型, 在 (nod)-科学背景中, 白细胞介素-2 受体γ链 (il2rg) 被截断或完全敲除。il2rg, 也被称为常见的细胞因子受体γ-链, 是各种细胞因子受体 10,11,12,13的不可缺少的组成部分。品种, 如 nod。cg-prkdcscidil2rgtm1wji (nsg) 和 nodshe.cg-prkdcscidil2rgtm1Wji (nog) 对小鼠细胞因子信号转导和 nk 细胞发育的完全消融造成了强大的干扰。此外, 适应性免疫有严重损伤,14, 15,16。

在艾滋病毒/艾滋病研究中经常使用三种具有科学突变和 il2rg 敲除的人的小鼠模型: blt (骨头 marrowyanglemesus) 模型、pbl (外周血白细胞模型) 和 src ( scid 反细胞模型)3. blt 模型是通过在小鼠肾囊下对人的胎儿肝脏和胸腺进行手术移植, 并伴有静脉注射胎儿肝 hsc3,17,18。blt 小鼠模型具有较高的雕刻效果, 在所有血统中开发人类造血细胞, 并建立强大的人体免疫系统;此外, t 细胞在人类自体胸腺中接受教育, 并表现出 hla 受 ha 限制的免疫反应4,5,17,19。然而, 外科手术的要求仍然是 blt 模型的主要缺点。通过与人外周淋巴细胞静脉注射建立 pbl 小鼠模型。pbl 模型提供了方便, 并产生了成功的 t 细胞雕刻, 但其应用有限, 由于不足的 b 细胞和骨髓细胞植皮, 较低的雕刻水平整体, 并开始严重的移植物抗宿主疾病 (gvhd)3 ,20。src 小鼠模型是通过向新生或年轻成人 scid 小鼠注射人 hsc 建立的。它表现出平均雕刻效率超过 25% (被评估为外周血 cd45 百分比), 并支持多系发展的注射 hsc 和制定一个先天的人体免疫系统。然而, src 模型的局限性在于 t 细胞响应是鼠标 h2 受限而不是人类 hla 受限14,21。

src 小鼠模型被认为是临床前艾滋病毒/艾滋病小动物研究的一个简单可靠的模型, 人类免疫系统的一致植入和造血发育的成功就是例证。我们以前报告了核供应国集团 hu-src-scid (hu-nsg) 小鼠模型的建立, 并介绍了其在艾滋病毒复制和延迟研究22、23、24 中的应用。这种 hu-nsg 小鼠模型显示了高水平的骨髓定位, 易感性的艾滋病毒感染, 并概述了 hiv 感染和发病机制。此外, hu-nsg 小鼠模型对组合抗逆转录病毒疗法 (cart) 作出适当反应, 并在 cart 退出后重述血浆病毒反弹, 确认建立了 25, 26 艾滋病毒潜伏期库 ,27岁。从受感染和 cot 治疗的 hu-nsg 小鼠身上分离出的人体外感染病毒的生产进一步证实了这一艾滋病毒潜伏期。

在此, 我们描述了从新生儿 nsg 小鼠建立 hu-nsg 小鼠模型的详细方案, 包括与 hiv 感染和 cart 治疗有关的潜伏期发展的程序。我们期望该协议在 hiv 动物研究中提供一套新的方法, 包括 hiv 病毒学、潜伏期和治疗。

Protocol

所有动物护理和程序都是根据希望城市机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 审查和批准的协议进行的, 该委员会由这项研究的主要调查员 (john rossi 博士, iacuc #12034) 持有。人类胎儿肝脏组织是根据联邦和州规定从高级生物科学资源 (加州阿拉米达) 获得的, 该资源是一个非营利组织。供应商有自己的机构审查委员会 (irb), 并符合人的主体保护要求。从希望市献血者中心 (加利福尼亚州杜阿尔特) 的匿名健…

Representative Results

流式细胞术分析经常进行, 以验证分离的 hsc 的纯度, 评估雕刻水平, 对病毒感染的特征免疫反应, 并调查相符的疗效。一个典型的抗体面板包含4-6 个荧光标记抗体;因此, 具有多个激光器和多种滤波器的流式细胞仪对于获得准确的结果至关重要。 对于初始雕刻验证, 人类 cd45 + 细胞计数可以从20% 到80% 不等, 人类白细胞的子集应该?…

Discussion

免疫损伤的小鼠与人的细胞组织一起存在着人类的生理特征, 对人类特有疾病的病理、病理生理学和免疫学研究具有巨大的价值。在免疫功能低下的多株小鼠中, nod。cg-prkdc科学il2rgtm1wji (nsg) 模型是最免疫缺陷的, 因为它缺乏先天免疫和适应性免疫, 以及消融的鼠特异性细胞因子信号 3,12, 19.因此, nsg 小鼠?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了国家卫生研究院 [赠款编号 r01ai29329、r01ai42552 和 r01hl07470 至 j. r.) 和国家卫生研究院国家癌症研究所 [赠款编号 p30ca033572 以支持希望城市综合基因组学] 的支持, 分析药理学和分析细胞计芯]。以下试剂是通过国家卫生研究院艾滋病研究和参考试剂方案、艾滋病司、niaid、nih 获得的: hiv bal 病毒。

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O’Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van’t Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Tags

Hu-NSG Mouse ModelHIV ReplicationHIV LatencyNon-invasiveHuman Stem CellsCD34+ HSCsNOD/SCID/IL2rγnull MiceCARTHIV InfectionEngraftment ValidationFlow Cytometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image