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Immunology and Infection

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58255
, , , ,
1Department of Molecular and Cellular Biology,Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences,Beckman Research Institute of City of Hope

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Methode zum humanisierten Mäuse (Hu-NSG) schaffen über intrahepatischen Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen in Strahlung bedingt neonatale NSG Mäuse. Die Hu-NSG-Maus ist anfällig für HIV-Infektion und kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und dient als ein geeignetes pathophysiologischen Modell für HIV-Replikation und Latenz-Untersuchungen.

Abstract

Ethischen Vorschriften und technischen Herausforderungen für die Forschung in menschliche Pathologie, Immunologie und therapeutische Entwicklung haben kleiner Tiermodelle in der hohen Nachfrage gelegt. Mit einer genetischen und Verhaltensstörungen Ähnlichkeit mit Menschen sind kleine Tiere wie der Maus gute Kandidaten für menschliche Krankheitsmodelle, durch die menschlich-wie Symptome und Antworten zusammengefaßt werden können. Darüber hinaus kann Maus genetischen Hintergrund geändert werden, um unterschiedlichen Anforderungen gerecht. Die NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) Maus ist eines der am weitesten verbreitete immungeschwächten Mausstämme; Es ermöglicht Engraftment mit humanen hämatopoetischen Stammzellen und/oder menschlichem Gewebe und die anschließende Entwicklung eines funktionellen menschlichen Immunsystems. Dies ist ein entscheidender Meilenstein in der Prognose und Pathophysiologie des Mensch-spezifische Krankheiten wie HIV/AIDS zu verstehen und unterstützen die Suche nach einem Heilmittel. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von einem humanisierten Mausmodell der NSG (Hu-NSG) von hämatopoetischen Stammzelltransplantation in eine Strahlung bedingt neonatale NSG Maus. Die Hu-NSG-Maus-Modell zeigt Multi-Linie Entwicklung der transplantierten Stammzellen und die Anfälligkeit für virale Infektion HIV-1. Es fasst auch wichtige biologische Eigenschaften als Reaktion auf kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART).

Introduction

Denn Festlegung geeigneter Tiermodelle für menschliche Krankheiten Schlüssel zur Suche nach einem Heilmittel, wurden entsprechende Tiere Modelle lange verfolgt und im Laufe der Zeit verbessert. Mehrere Stämme von immungeschwächten murinen Modelle wurden entwickelt, die das Engraftment von menschlichen Zellen bzw. Gewebe und die anschließende Ausführung von humanisierten Funktionen1,2zulassen. Solchen humanisierte Mausmodelle sind entscheidend für Untersuchungen von Mensch-spezifische Krankheiten3,4,5.

Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) durch Infektion mit dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) ist ein Beispiel. Vor der Gründung der humanisierte Mausmodelle beschränkt ethischen und technische Einschränkungen HIV/AIDS präklinische tierexperimentellen Studien an nicht-humanen Primaten3. Allerdings behindern die hohen Kosten und Anforderungen für Spezialbehandlungen für solche Tier HIV/AIDS Studien in typischen akademischen Umfeld. Vor allem HIV infiziert menschliche CD4 + T-Zellen und wirkt sich auf die Entwicklung und die Immunantwort von anderen menschlichen Immunzellen wie B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen6; gefragt sind daher kleiner Tiermodelle mit funktionalen menschlichen Immunsystem transplantiert.

Einen Durchbruch im Jahr 1988, als CB17 –scid -Mäuse mit einer Prkdcscid -Mutation entwickelt wurden und zeigte erfolgreiche Engraftment des menschlichen Immunsystems1. Der Prkdcscid -Mutation resultiert Defekte T – und B-Zell-Funktionen und eine Ablation adaptiven Immunsystems bei Mäusen, wodurch das Engraftment des menschlichen peripheren Mononukleäre Zellen (PBMCs), hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), Blut und fetalen hämatopoetischen Geweben7,8. Dennoch werden geringe Mengen an Engraftment häufig in diesem Modell beobachtet; mögliche Ursachen sind 1) verbleibende angeborene Immunaktivität moduliert über natürliche Killer (NK)-Zellen und (2) der späten Entwicklung der Maus T – und B-Zellen (Undichtigkeit)5. Die spätere Entwicklung der nicht-adipösen Diabetiker (NOD)-scid -Maus-Modell erreicht dramatische Down-Regulierung von NK-Zell-Aktivität; so ist es in der Lage, ein höheres Niveau und weitere nachhaltige Engraftment des menschlichen Immunsystems Komponenten9zu unterstützen. Weiter zu unterdrücken oder hemmen die Entwicklung der angeborenen Immunität, Maus-Modellen (NOD) abschneiden oder total KO von Interleukin-2 Rezeptor γ-Kette (Il2rg) eingedenk –scid Hintergrund entstanden. Il2rg, auch bekannt als gemeinsame Zytokin-Rezeptor γ-Kette, ist ein unverzichtbarer Bestandteil von verschiedenen Zytokin-Rezeptoren10,11,12,13. Stämme wie NICKEN. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) und NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) präsentieren Sie robuste Störung der Maus Cytokine signaling und vollständige Abtragung der NK-Zell-Entwicklung, Zusätzlich zu schwerer Beeinträchtigung der adaptiven Immunität14,15,16.

Drei humanisierte Mausmodelle trägt ein scid -Mutation und Il2rg Knockout werden häufig eingesetzt, in HIV/AIDS-Forschung: der BLT (Knochenmark, Leber, Thymus) Modell, das PBL (periphere Blut Leukozyten) Modell und das SRC (SCID Repopulating Zelle) Modell 3. der BLT-Modell wird über chirurgische Transplantation von menschlichen fetalen Leber und Thymus unter der Maus Niere Kapsel begleitet mit intravenöser Injektion der fetalen Leber HSCs3,17,18erstellt. Die BLT-Maus-Modell bietet hohe Engraftment Wirksamkeit, Entwicklung menschlicher hämatopoetischen Zellen in allen Linien und Etablierung eines starken menschlichen Immunsystems; Zusätzlich T-Zellen sind in einem menschlichen autologen Thymus ausgebildet und weisen HLA-eingeschränkten Immunantwort4,5,17,19. Die Forderung nach chirurgischen Eingriffen bleibt jedoch den großen Nachteil das BLT-Modell. Die PBL-Maus-Modell wird durch intravenöse Injektion mit menschlichen peripheren lymphatischen Zellen aufgebaut. Das PBL-Modell bietet Komfort und erfolgreiche T-Zell-Engraftment ergibt, aber seine Anwendung ist begrenzt aufgrund unzureichender B-Zell und myeloische Zellen Engraftment, niedrige Engraftment Ebenen insgesamt und das Auftreten von schweren Graft – Versus – Host-Seuche (GVHD)3 ,20. Die SRC-Maus-Modell wird durch Injektion von menschlichen HSCs in Neugeborenen oder jungen Erwachsenen SCID Mäuse hergestellt. Es weist durchschnittliche Engraftment Effizienz über 25 % (gemessen als peripheren Blut CD45 Prozentsatz) und unterstützt die Entwicklung der Multiple-Linie des injizierten HSCs und die Ausarbeitung eines angeborenen menschlichen Immunsystems. Die Beschränkung der SRC-Modells ist jedoch, dass die T-Zell-Antwort ist Maus H2 statt menschliche HLA-eingeschränkten14,21beschränkt.

Die SRC-Maus-Modell gilt als einfache und zuverlässige Vorbild für präklinische HIV/AIDS kleine Tierstudien, veranschaulicht durch die konsequente Engraftment eines menschlichen Immunsystem und erfolgreiche hämatopoetischen Entwicklung. Wir zuvor berichtet die Errichtung einer NSG Hu-SRC-SCID (Hu-NSG) Maus-Modell und seine Anwendung in der HIV-Replikation und Latenz Studien22,23,24beschrieben. Diese Hu-NSG Mausmodell weist hohe Knochenmark Homing, Anfälligkeit für eine HIV-Infektion und Reprise der HIV-Infektion und Pathogenese. Darüber hinaus die Hu-NSG-Maus-Modell reagiert angemessen auf kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und rekapituliert Plasma viralen Rebound nach Warenkorb Zurücknahme, bestätigt die Gründung einer HIV Latenz Reservoir25,26 ,27. Diese HIV-Latenz-Reservoir ist weiter durch die Produktion von Replikation-kompetente HIV Viren Ex Vivo induziert durch menschliche ruhenden CD4 + T-Zellen isoliert von infizierten und Wagen behandelt Hu-NSG Mäuse belegt.

Hier beschreiben wir das ausführliche Protokoll für Einrichtung von Hu-NSG-Maus-Modell von Neugeborenen NSG-Mäusen, einschließlich der Verfahren im Zusammenhang mit HIV-Infektion und Karren Behandlung für Latenz-Entwicklung. Wir erwarten, dass dieses Protokoll eine Reihe neue Ansätze in HIV tierexperimentellen Studien bezüglich HIV Virologie, Latenz und Behandlung anbieten.

Protocol

Alle Tierpflege und Verfahren wurden nach Protokollen überprüft und genehmigt durch die Stadt der Hoffnung institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) im Besitz der principal Investigator der Studie (Dr. John Rossi, IACUC #12034) durchgeführt. Menschlichen fetalen Lebergewebe wurde von Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA), eine gemeinnützige Organisation, Bundes- und einzelstaatlichen Vorschriften erhalten. Der Lieferant hat seine eigenen institutionellen Review Board (IRB) und ist kompatibel mit…

Representative Results

Flow-Zytometrie-Analyse wird häufig durchgeführt, um die Reinheit der isolierten HSCs zu validieren, Engraftment Ebenen, Profil Immunantwort auf virale Infektion, zu bewerten und Übersicht Warenkorb Wirksamkeit. Eine typische Antikörper-Panel enthält 4-6 individuelle Eindringmittel beschriftete Antikörper; Daher ist ein Durchflusszytometer mit mehreren Lasern und eine große Auswahl an Filter entscheidend, um genaue Ergebnisse zu erzielen. <p class="jove_content" fo:keep-togethe…

Discussion

Immungeschwächte Mäuse mit menschlichen Zellen/Gewebe pfropfte menschenähnliche physiologische Merkmale aufweisen und einen enormen Wert für Pathologie, Pathophysiologie und Immunologie Studien zur Mensch-spezifische Krankheiten sind. Unter mehreren Stämmen immungeschwächte Mäuse, den Zuschlag. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) Modell ist die am meisten immungeschwächte aufgrund seiner mangelnden angeborenen und der adaptiven Immunität sowie abgetragene Maus-spezifischen Cytokine sig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [gewähren, J.J.R. Zahlen, R01AI29329, R01AI42552 und R01HL07470] und National Cancer Institute der National Institutes of Health [Grant-Nummer P30CA033572, Stadt der Hoffnung Integrative Genomics zu unterstützen Analytische Pharmakologie und analytische Zytometrie Kerne]. Die folgende Reagenz wurde durch die AIDS-Forschung NIH und Referenzprogramm Reagenz, Division of AIDS NIAID, NIH erhalten: BaL HIV Virus.

Materials

CD34 MicroBead Kit, human MiltenyiBiotec 130-046-703
CryoStor CS2 Stemcell Technologies 07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory 005557 Order breeders instead of experimental mice
IsoFlo Patterson Veterinary 07-806-3204 Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectant Fisher Sicentific NC9189926
Wescodyne Fisher Sicentific 19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needle Hamilton 80508 Custom made
Blood collection tube (K2EDTA) BD Bioscience 367843
Blood collection tube (Heparin) BD Bioscience 365965
Capillary tube (Heparinized) Fisher Sicentific 22-362574
Red Blood Cell Lysis Buffer Sigma Aldrich 11814389001
QIAamp Viral RNA mini kit Qiagen 52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix Thermofisher 4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) PerkinElmer NEK050B001KT
IgG from human serum Sigma Aldrich I4506-100MG
IgG from mouse serum Sigma Aldrich I5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) BD Biosciences 564586 RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) BD Biosciences 557851 RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) BD Biosciences 558116 RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) BD Biosciences 563795 RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) ThermoFisher MHCD1427 RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) ThermoFisher MHCD1904 RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
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References

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Xia, X., Li, H., Satheesan, S., Zhou, J., Rossi, J. J. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J. Vis. Exp. (143), e58255, doi:10.3791/58255 (2019).
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