פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.
תקנות אתיות ואתגרים טכניים לחקר פתולוגיה אנושית, אימונולוגיה ופיתוח טיפולית יש להציב מודלים בעלי חיים קטנים ביקוש גבוה. עם קרוב גנטיות והתנהגותיות דימיון של בני אדם, חיות קטנות כמו העכבר הם מועמדים טובים עבור מחלות אנושיות מודלים, שדרכו תסמינים דמויי אנוש ותגובות יכול להיות recapitulated. יתר על כן, ניתן לשנות את הרקע הגנטי של העכבר כדי להתאים לדרישות מגוונות. העכברnull (NSG) הנד/SCID/IL2rγ הוא אחד של זנים העכבר immunocompromised הנפוצה ביותר; זה מאפשר engraftment עם תאי גזע אנושי hematopoietic ו/או ברקמות אנושיות ופיתוח עוקבות של מערכת החיסון האנושית פונקציונלי. . זה יהווה אבן דרך קריטית להבנת הפרוגנוזה של הפתופיזיולוגיה של האדם הספציפי מחלות כמו איידס, סיוע בחיפוש אחר תרופה… במסמך זה, מדווחים פרוטוקול מפורט ליצירת מודל העכבר NSG humanized (hu-NSG) על ידי השתלת תא גזע hematopoietic לתוך עכבר ממוזגים קרינה NSG neonatal. המודל העכבר hu-NSG מציגה פיתוח השושלת רב המושתלים תאי גזע אנושי הרגישות לזיהום נגיפי HIV-1. זה גם recapitulates מאפיינים ביולוגיים מרכזיים בתגובה לטיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה).
כי הקמת בדגמים בעלי חיים מסוימים עבור מחלות אנושיות היא המפתח למציאת תרופה, מודלים בעלי חיים המתאימים זמן היה נרדף, שיפור לאורך זמן. פותחו זנים מרובים של מודלים מאתר immunocompromised, כי היתר את engraftment של רקמות או תאים אנושיים והוצאה לפועל עוקבות של פונקציות humanized1,2. מודל העכבר humanized שכזה הם קריטיים עבור חקירות של מחלות האדם הספציפי3,4,5.
אידס (איידס) הנובע זיהום עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) הוא דוגמה אחת. לפני הקמת העכבר humanized מודלים, אתיים ומגבלות טכניות מוגבלת HIV/איידס פרה מחקרים שנעשו בבעלי חיים קופים3. עם זאת, הוצאות גבוהה ודרישות עבור טיפול מיוחדים עבור חיה כזאת לעכב HIV/איידס בלימודים אקדמיים הגדרות אופייניות. HIV בעיקר מדביק CD4 + T-תאים אנושיים, משפיעה על פיתוח, תגובות מערכת החיסון של תאים חיסוניים אנושיים אחרים כגון תאי-B, מקרופאגים תאים דנדריטים6; לכן, מודלים בעלי חיים קטנים מושתלים עם תפקודי מערכות החיסון האנושית יש ביקוש גבוה.
פריצת דרך הגיע בשנת 1988, כאשר היו עכברים CB17 –scid עם מוטציה Prkdcscid פיתח והראה engraftment מוצלחת של מערכת החיסון האנושית1. התוצאות Prkdcscid מוטציה בפונקציות פגומים T – ו B-cell, מערכת חיסונית אדפטיבית ablated בעכברים, ובעקבותיו את engraftment של האדם ההיקפית תאי תאי (PBMCs), תאי גזע hematopoietic (HSCs), הדם, רקמות העובר hematopoietic7,8. עם זאת, רמות נמוכות של engraftment הם נצפו לעתים קרובות במודל זה; סיבות אפשריות הן 1) שיורית הפעילות החיסונית מולדת מאופנן באמצעות הרוצח הטבעיים (NK)-תאים ופיתוח 2) בשלב מאוחר של העכבר T – ו B-תאים (leakiness)5. התפתחות סוכרת שאינו שמנים (הנד) עוקבות-scid העכבר דגם מושגת דרמטי למטה-ויסות פעילות תאי NK; לפיכך, הוא מסוגל לתמוך לרמה גבוהה יותר engraftment בר-קיימא של רכיבי מערכת החיסון האנושית9. בכדי לדכא או לעכב התפתחות של מולדת חסינות, מודלים העכבר זוקף לחיתוך או מהממת של interleukin-2 קולטן γ-הרשת (Il2rg) (הנד) –scid רקע הוקמו. Il2rg, הידוע גם בשם נפוץ ציטוקין קולטן γ שרשרת, היא מרכיב חיוני של שונים ציטוקין קולטנים10,11,12,13. זנים כמו במנוד ראש. Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug (ליקר) נוכח שיבוש חזקים העכבר ציטוקין איתות ו אבלציה מלאה של התפתחות תאי NK, ב בנוסף ליקוי חמור של חסינות מסתגלת14,15,16.
שלושה דגמים העכבר humanized הנושאת scid מוטציה, נוקאאוט Il2rg לעתים קרובות המועסקים ב- HIV/איידס המחקר: המודל בייקון (מח עצם הכבד קורנית) את מודל למידה (ליקוציט דם היקפיים), המודל SRC (SCID לאכלס מחדש תא) 3. בייקון מודל נוצר באמצעות ניתוח השתלת כבד עוברי אנושי, התימוס מתחת הקפסולה כליות העכבר בליווי ורידיות העובר בכבד HSCs3,17,18. המודל העכבר BLT מציע יעילות גבוהה engraftment, התפתחות תאים אנושיים hematopoietic בתוך כל שושלות, והקמת מערכת חיסונית חזקה האנושי; בנוסף, תאי-T משכילים ב בלוטת התימוס עצמיים אנושית ולהציג מוגבלת הלע תגובות חיסוניות4,5,17,19. עם זאת, הדרישה ניתוחים נשאר החיסרון העיקרי של המודל BLT. המודל העכבר למידה נוסדה על ידי זריקה תוך ורידי עם תאי הלימפה היקפי אדם. מודל למידה מציע נוחות ותשואות engraftment T-cell מוצלחת, אבל היישום שלו הוא מוגבל בשל תאי B לא מספיק מיאלואידית תא engraftment, רמות נמוכות engraftment הכללית, ואת תחילתה של חמור שתל – מול – מארח מחלות (GVHD)3 ,20. המודל העכבר SRC נקבעת באמצעות הזרקה של האדם HSCs לתוך עכברים SCID היילוד או צעירים למבוגרים. זה מוצגים engraftment הממוצע יעילות מעל 25% (העריכו דם היקפיים CD45 אחוז) ותומך פיתוח מרובת-השושלת HSCs מוזרק, לפתח את מערכת החיסון האנושית מולדת. עם זאת, המגבלה של המודל SRC היא כי התגובה תא T הוא עכבר H2-מוגבל במקום האנושי מוגבלת הלע14,21.
המודל העכבר SRC נחשב למודל נתיישב ואמין פרה HIV/איידס קטן מחקרים שנעשו בבעלי חיים, ומעוררות את engraftment עקבית של מערכת החיסון האנושית ופיתוח hematopoietic מוצלח. אנו קודם לכן דיווח על הקמת מודל העכבר NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG), תיאר את היישום שלה שכפול HIV, השהיה מחקרים22,23,24. מודל זה העכבר hu-NSG תערוכות רמות גבוהות של מח עצם יונת, הרגישות הידבקות ב- HIV, ואת החוק הביוגנטי של הידבקות ב- HIV ו פתוגנזה. בנוסף, דגם hu-NSG העכבר מגיב כראוי לטיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), recapitulates פלזמה ריבאונד ויראלי על העגלה נסיגה, המאשרת הקמת HIV השהיה מאגר25,26 ,27. זה מאגר השהיה HIV עוד תימוכין על ידי הייצור של המוסמכים-שכפול HIV וירוסים לשעבר vivo המושרה על ידי האדם נח CD4 + T תאים מבודדים של עכברים נגועים ו שטופלו העגלה hu-NSG.
במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור הקמת המודל העכבר hu-NSG של עכברים NSG neonatal, לרבות ההליכים הקשורים זיהום ב- HIV וטיפול העגלה לפיתוח השהיה. אנו מצפים פרוטוקול זה להציע סט חדש של גישות במחקרים בעלי חיים HIV לגבי HIV וירולוגיה, השהיה, וטיפול.
עכברים immunocompromised engrafted עם תאים/רקמה אנושית להציג מאפיינים פיזיולוגיים דמוי אדם, ערך עצום ללימודי פתולוגיה, פתופיזיולוגיה ו אימונולוגיה לגבי אדם ספציפי במחלות. בין הזנים מרובים של עכברים immunocompromised, הסימן. Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) הדגם הוא immunodeficient ביותר בשל חוסר חסינות מולדת והן א?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [להעניק מספרים R01AI29329, R01AI42552, R01HL07470 J.J.R.] מכון הסרטן הלאומי של מכוני הבריאות הלאומיים [מספר גרנט P30CA033572 כדי לתמוך עיר של תקווה אינטגרטיבית גנומיקה פרמקולוגיה אנליטית, ליבות Cytometry אנליטית]. הכימית הבאה הושג באמצעות הפניה ריאגנט התוכנית, חלוקה של איידס, NIAID, ומחקר של איידס NIH NIH: HIV BaL וירוס.
CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |