Dit protocol biedt een methode om vast te stellen gehumaniseerd muizen (hu-NSG) via Intrahepatische injectie van menselijke hematopoietische stamcellen in straling-geconditioneerd neonatale NSG muizen. De hu-NSG muis is gevoelig voor HIV-infectie en combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en dient als een geschikt pathofysiologisch model voor HIV-replicatie en latentie onderzoeken.
Ethische regels en technische uitdagingen voor onderzoek in de menselijke pathologie, immunologie en therapeutische ontwikkeling hebben kleine diermodellen geplaatst in hoge vraag. Met een nauwe genetische en gedragsmatige gelijkenis met mensen zijn kleine dieren zoals de muis goede kandidaten voor ziekten bij de mens modellen, waarlangs mens-achtige symptomen en reacties kunnen worden gerecapituleerd. Verder kan de genetische achtergrond van muis aangepast aan uiteenlopende eisen worden gewijzigd. De KNIPOOG/SCID/IL2rγnull (NSG) muis is één van de meest gebruikte immuungecompromitteerde muis spanningen; Hierdoor engraftment met menselijke hematopoietische stamcellen en/of menselijke weefsels en de verdere ontwikkeling van een functionele menselijk immuun systeem. Dit is een kritieke mijlpaal in het begrip van de prognose en pathofysiologie van mens-specifieke ziekten zoals HIV/AIDS en medeplichtigheid aan het zoeken naar een remedie. Hierin, rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van een gehumaniseerd NSG muismodel (hu-NSG) door hematopoietische stamceltransplantatie in een muis neonatale NSG straling-geconditioneerd. De hu-NSG muismodel toont meerdere lineage ontwikkeling van getransplanteerde menselijke stamcellen en de gevoeligheid voor HIV-1 virale infectie. Het recapituleert ook belangrijke biologische kenmerken in respons op combinatorische antiretrovirale therapie (cART).
Omdat de vaststelling van geschikte diermodellen voor ziekten bij de mens is de sleutel tot het vinden van een remedie, hebben passende dieren modellen lang voortgezet en verbeterd na verloop van tijd. Meerdere stammen van immuungecompromitteerde lymfkliertest modellen zijn ontwikkeld die de engraftment van menselijke cellen en/of weefsels en de latere uitvoering van gehumaniseerd functies1,2 toelaten. Dergelijke gehumaniseerd Muismodellen staan kritisch tegenover voor onderzoek van mens-specifieke ziekten3,4,5.
Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) als gevolg van infectie met het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) is een voorbeeld. Voorafgaand aan de vaststelling van gehumaniseerd Muismodellen beperkt ethische en technische beperkingen HIV/AIDS preklinische dierstudies naar niet-menselijke primaten3. Echter, de hoge kosten en vereisten voor gespecialiseerde zorg voor zo’n dier een belemmering vormen voor HIV/AIDS studies in typische academische instellingen. HIV voornamelijk infecteert menselijke CD4 + T-cellen en impact van de ontwikkeling en de immuunrespons van andere menselijke immune cellen zoals B-cellen, macrofagen en dendritische cellen6; kleine dierlijke modellen met een functionele menselijk immuunsysteem getransplanteerd zijn daarom in hoge vraag.
Een doorbraak kwam in 1988, toen CB17 –scid muizen met een mutatie Prkdcscid ontwikkeld en succesvolle engraftment van het menselijke immuunsysteem1toonde. De resultaten van de mutatie Prkdcscid in defecte T – en B-cel-functies en een ablated adaptieve immuunsysteem in muizen, waardoor de engraftment van menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), hematopoietische stamcellen (HSCs), en foetale hematopoietische weefsels7,8. Niettemin, lage niveaus van engraftment worden vaak waargenomen bij dit model; mogelijke oorzaken zijn 1) residuele aangeboren immuun activiteit gemoduleerd via natural killer (NK)-cellen en 2) de ontwikkeling van de late-stadium van muis T – en B-cellen (leakiness)5. De verdere ontwikkeling van de nietzwaarlijvige diabetische (NOD)-scid muismodel bereikt dramatische down-regulatie van de activiteit van de NK-cel; het is dus een hoger niveau en meer duurzame engraftment van menselijke immuunsysteem componenten9kunnen steunen. Verder onderdrukken of belemmeren de ontwikkeling van aangeboren immuniteit, Muismodellen truncation of totale knockout van de interleukin-2 receptor γ-keten (Il2rg) rekening houdend met in de (NOD) –scid achtergrond werden opgericht. Il2rg, ook bekend als gemeenschappelijk cytokine-receptor γ-keten, is een onmisbaar onderdeel van verschillende cytokine receptoren10,11,12,13. Stammen zoals de KNIPOOG. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) en NODShi.Cg –PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presenteren robuuste verstoring van muis cytokine signalering en volledige ablatie van NK-cel ontwikkeling, in aanvulling op ernstige aantasting van adaptieve immuniteit14,15,16.
Drie gehumaniseerd muismodellen, rekening houdend met een scid mutatie en Il2rg knock-out in HIV/AIDS-onderzoek vaak werkzaam zijn: de BLT (beenmerg/lever/zwezerik)-model, het model van de PGO (perifere bloed leukocyten) en de SRC (SCID repopulatie cel) model 3. de BLT model is gemaakt via chirurgische transplantatie van menselijke foetale lever en thymus onder de muis nier capsule vergezeld met intraveneuze injectie van foetale lever HSCs3,17,18. De BLT muismodel biedt hoge engraftment werkzaamheid, ontwikkeling van menselijke hematopoietische cellen in alle geslachten, en totstandbrenging van een sterke menselijke immuunsysteem; Daarnaast is T-cellen zijn opgeleid in een menselijke autologe zwezerik en vertonen immuunresponsen HLA-beperkte4,5,17,19. De eis voor chirurgische procedures blijft echter het belangrijkste nadeel van de BLT-model. De muismodel van PGO is opgericht door intraveneuze injectie met menselijke perifere lymfoïde cellen. Het PGO-model biedt gemak en succesvolle T-cel engraftment levert, maar de toepassing ervan is beperkt als gevolg van onvoldoende B-cel en myeloïde cel engraftment, laag engraftment niveau algemene en het ontstaan van ernstige graft – versus – host-ziekte (GVGH)3 ,20. De SRC muismodel is door injectie van menselijke HSCs in pasgeboren of jonge volwassen SCID muizen aangetoond. Het gemiddelde engraftment efficiëntie boven 25% (beoordeeld als perifeer bloed CD45 percentage) vertoont en ondersteunt de ontwikkeling van meerdere-bloedlijn van geïnjecteerd HSCs en het uitwerken van een aangeboren menselijke immuunsysteem. De beperking van het SRC-model is echter dat de T-cel-respons is muis H2-beperkt in plaats van menselijke HLA-beperkte14,21.
De SRC muismodel wordt beschouwd als een model voor facile en betrouwbare voor preklinische HIV/AIDS kleine dierlijke studies, wordt geïllustreerd door het consistent engraftment van een menselijke immuunsysteem en succesvolle hematopoietische ontwikkeling. Wij eerder gemeld van de oprichting van een muismodel NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) en de toepassing ervan in de HIV-replicatie en latentie studies22,23,24beschreven. Deze hu-NSG muismodel vertoont hoge niveaus van beenmerg homing, gevoeligheid voor HIV-infectie, en de recapitulatie van HIV-infectie en pathogenese. Bovendien, de hu-NSG muismodel correct reageert op combinatorische antiretrovirale therapie (cART) en recapituleert de virale rebound plasma bij kar geldopname, bevestiging van de oprichting van een HIV latency reservoir25,26 ,27. Dit reservoir van HIV latency wordt verder onderbouwd door overlegging van replicatie-bevoegde HIV virussen ex vivo geïnduceerd door mens rust CD4 + T-cellen van geïnfecteerde en kar-behandeld hu-NSG muizen geïsoleerd.
Hierin beschrijven we de gedetailleerd protocol voor oprichting van de hu-NSG muismodel van neonatale NSG muizen, met inbegrip van de procedures met betrekking tot HIV-infectie en kar behandeling voor latency ontwikkeling. Wij verwachten dat dit protocol te bieden een nieuwe reeks van benaderingen in HIV dierlijke studies met betrekking tot HIV Virologie, latency en behandeling.
Immuungecompromitteerde muizen geaccepteerd met menselijke cellen/weefsels fysiologische kenmerken van mens-achtig aanwezig en een enorme waarde voor immunologie, pathologie en pathofysiologie studies betreffende mens-specifieke ziekten. Onder meerdere muizenstammen immuungecompromitteerde, de knik. CG –PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) model is het meest immunodeficiëntie als gevolg van het ontbreken van zowel aangeboren en adaptieve immuniteit, evenals ablated worden muis-specifieke cytokine s…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [J.J.R. verlenen nummers R01AI29329, R01AI42552 en R01HL07470] en het National Cancer Institute van de National Institutes of Health [subsidie nummer P30CA033572 ter ondersteuning van de stad van hoop integratieve Genomics Analytische farmacologie en analytische Cytometry Cores]. De volgende reagens werd verkregen door de NIH AIDS-onderzoek en reagens referentieprogramma, divisie van AIDS, NIAID, NIH: BaL van het HIV-virus.
CD34 MicroBead Kit, human | MiltenyiBiotec | 130-046-703 | |
CryoStor CS2 | Stemcell Technologies | 07932 | |
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji | The Jackson Laboratory | 005557 | Order breeders instead of experimental mice |
IsoFlo | Patterson Veterinary | 07-806-3204 | Order through animal facility, restricted item |
Clidox disinfectant | Fisher Sicentific | NC9189926 | |
Wescodyne | Fisher Sicentific | 19-818-419 | |
Hamilton 80508 syringe/needle | Hamilton | 80508 | Custom made |
Blood collection tube (K2EDTA) | BD Bioscience | 367843 | |
Blood collection tube (Heparin) | BD Bioscience | 365965 | |
Capillary tube (Heparinized) | Fisher Sicentific | 22-362574 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma Aldrich | 11814389001 | |
QIAamp Viral RNA mini kit | Qiagen | 52906 | |
TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix | Thermofisher | 4444434 | |
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit) | PerkinElmer | NEK050B001KT | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506-100MG | |
IgG from mouse serum | Sigma Aldrich | I5381-10MG | |
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30) | BD Biosciences | 564586 | RRID: AB_2732068, LOT 6347696 |
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7) | BD Biosciences | 557851 | RRID: AB_396896, LOT 6021877 |
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4) | BD Biosciences | 558116 | RRID: AB_397037, LOT 6224744 |
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8) | BD Biosciences | 563795 | RRID: AB_2722501, LOT 6210668 |
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4) | ThermoFisher | MHCD1427 | RRID: AB_10373536, LOT 1684947A |
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1) | ThermoFisher | MHCD1904 | RRID: AB_10373382, LOT 1725304B |