Ifnar1– / – fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.
Zika virüs (ZIKV) iltihap immunoprivileged organlarda (Örneğin, beyin ve testis), Guillain-Barré sendromu için önde gelen ve testis zarar neden olabilir. ZIKV ile bir enfeksiyon sırasında bağışıklık hücreleri doku sızmak için gösterilmiştir. Ancak, koruma ve/veya immunopathogenesis bu bağışıklık hücrelerinin ZIKV enfeksiyon sırasında tanımlamak hücresel mekanizmaları hala büyük ölçüde bilinmeyen vardır. Burada, bu immunoprivileged organların farelerin ZIKV bulaştırmak virüs özgü T-hücre işlevindeki değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntemler içerir bir) bir ZIKV enfeksiyon ve aşı aşı Ifnar1 farelerde;– / – b) histopatoloji, ayirt ve bulmak belgili tanımlık virüs enfeksiyonu ve inflamasyon beyin, testis ve dalak için immünhistokimya deneyleri; c) ZIKV elde edilen T-hücre epitopları tetramer hazırlanması; d) ZIKV özgü T hücreleri beyin, testis ve dalak izole monosit tespiti. Bu yaklaşımları kullanarak, immunoprivileged organları sızmış antijen spesifik T hücreleri tespit etmek ve bu T hücrelerinin işlevler enfeksiyon sırasında değerlendirmek için mümkündür: potansiyel bağışıklık koruma yolu ile virüs temizleme ve iltihap azdırmak için/veya immunopathogenesis. Bu bulgular da katkı ZIKV karşı aşı indüklenen T hücrelerinin netleştirmek için yardımcı olabilir.
ZIKV ilk 1947 yılında Uganda bir febril rhesus makak izole bir sivrisinek kaynaklı flavivirus var. Son zamanlarda, ZIKV bir halk sağlığı acil, Amerika’nın ve onun beklenmedik bağlantı microcephaly ve Guillain-Barré sendromu1,2,3, hızlı yayılması nedeniyle olmuştur. Epidemiyolojik veri, ZIKV yaklaşık 1 4.000 başına Guillain-Barré sendromu nedeni olarak yetişkin4enfekte şüphelenmiştir. Ayrıca, ZIKV ve testislerde enfeksiyon/hasar fare modeli arasında bir ilişki, belirli koşullar altında ZIKV enfeksiyon kan-testis bariyeri atlamak ve sonunda erkek kısırlığı5 kurşun düşündüren gösterilmiştir . Bu bulgular koruyucu veya patolojik bağışıklık yanıtı indüksiyon ZIKV enfeksiyon sırasında büyük bir anlayışla önemini vurgulayın.
Çok ZIKV hücresel bağışıklık yanıtlarını hakkında öğrenilmesi gereken kalır. CD4+ ve CD8+ T hücre kapsid, zarf ve mekansal protein 1 (NS1) yanıt ZIKV enfekte maymunlar ve insanlar6,7,8‘ de görülmektedir. Farelerde, çeşitli çalışmalar göstermiştir bu CD8+ T hücre ZIKV çoğaltma9,10,11kontrolünde koruyucu bir rol oynamaktadır. Önemlisi, Jurado vd. ZIKV enfeksiyon kan – beyin bariyerini dağılımı ve CD8 perivasküler infiltrasyon sonuçları gösterdi+ Ifnar1– / – fareler testis içinde efektör T hücreleri. Ayrıca, onlar gösterdi ki CD8+ T hücre ZIKV ilişkili paralizi uyanmaya ve neonatal beyin immunopathology bir rol oynamaya görünür. Bir önceki çalışmada, ZIKV-E294-302 tetramer hazırlanan ve gösterdi o ZIKV özgü CD8+ T hücreleri mevcut beyin ve omurilik kordonlar farelerin tasarımı için önemli sonuçları olabilir ZIKV enfekte Ifnar1– / – , ve ZIKV aşılar10gelişimi.
Aşı ZIKV enfeksiyonu önlemek için acil bir ihtiyaç yanıt olarak, çeşitli aşılar geliştirme, RNA aşıları, vektör tabanlı rekombinant aşı ve saf protein alt birimi aşılar gibi preklinik aşamasında bulunmaktadır. Plazmid DNA faz 1 klinik çalışmalarda12‘ aşıdır. Emanet değerlendirilmesi ve ZIKV aşı etkinliği, bu nedenle önemlidir. Aşılar bir avantajı ZIKV karşı koruma için önemli olabilir belirli T hücreli yanıt temin için onların yeteneğidir. ZIKV türetilmiş T-hücre epitope ile ilgili tetramers kullanarak, adenovirus vektör tabanlı ZIKV aşı tarafından indüklenen T-hücre immunoreactivity aşılı farelerde tespit edilemedi ve M ve E glikoproteinlerin sağlam antijen spesifik CD8 ikna etmek için gösterildi+ T-hücre immunoreactivity13.
Bir virüs enfeksiyonu sırasında ana bilgisayar14korumak için önemli bir T-hücre-aracılı mekanizma MHC kompleksi (MHC) molekülleri için T-hücre reseptör (TCR) tarafından sunulan peptid antijenleri bilinmesidir. Bu teorisi dayalı, tetramer teknoloji antijen spesifik T hücreleri bağışıklık yanıtı15düzenlenmesinde oynamak rolleri aydınlatmak için eşsiz bir araçtır. Bu iletişim kuralı ZIKV enfeksiyonlar için Ifnar1– / – fare modeli kurulması ve reaktif T hücreleri dalak, beyin ve testis farelerin tespiti tetramer teknolojisini kullanarak açıklar. Ayrıca, ZIKV-E294-302 tetramer algılamak ve T-hücre immunoreactivity aşılı farelerde ZIKV aşı (AdC7-M/E) tarafından indüklenen değerlendirmek için kullanılır. Bu çalışmada T-hücre yanıt immunoprivileged organlarda soruşturma ile ilgili yönergeler sağlar ve plasenta veya fetal beyin potansiyel uygulamalar için bir referans sağlar.
İmmunojenik T hücreli epitope hücresel bağışıklık patojenlere23karşı önemli bir rol oynar. Böylece, ZIKV özgü T hücreleri immunoprivileged organlarda tespiti doğal ZIKV bulaşmasına karşı T hücreli yanıt-e doğru anlamak için kritik bir metodoloji olduğunu. Bu arada, T-hücre yanıt algılama viral aşı etkinliği araştırmak için mükemmel bir araçtır. İşte, dalak, beyin ve testis ZIKV enfekte farelerin, immunodominant epitope E294-302 tetramer hazırlanması lenfositlerin yalıtım içeren deneyler, görselleştirmek için kapsamlı bir protokol göstermektedir ve ZIKV özgü CD8 tanınması+ T hücreleri immunoprivileged fareler ZIKV etkilenmiş organlarda.
Bir önceki çalışma canlı bir ZIKV veya kendi RNA ZIKV kan-testis bariyeri atlamak ve üreme sistemi24saat içinde kendisini çoğaltmak belirten meni erkek hastaların içinde algılanabilen gösterdi. Daha önce biz de ZIKV testis hasarına neden ve fareler25erkek kısırlığı yol gösterdi. ZIKV enfeksiyon viremi rhesus maymunları içinde yol açabilir ve viral RNA viseral organlar yanı sıra, merkezi sinir sistemi (MSS) tespit edilebilir. İmmünhistokimya ZIKV özgü antijenlere MSS ve birden çok periferik organlarda26sunuldu ortaya koydu. Ayrıca, fare modellerinde, sağlam bir antiviral CD8 ZIKV enfeksiyon neden olabilir+ T hücre yanıt olarak dalak ve CNS26.
Önceki çalışmaya göre bu çalışmada ZIKV özgü CD8 algılamak için sistematik yöntemleri kurar+ T hücre yanıt beyin ve testis, immunoprivileged sitelerdir. Virüs özgü T hücreleri ZIKV enfekte farelerin immunoprivileged organlarında işlevselliğini değerlendirmek önemlidir. ZIKV özgü CD8 algılamak için tetramers kullanımını+ T-hücre immunoprivileged organlarda yanıt büyük ZIKV enfeksiyonlar ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtlarını anlayışımızı geliştirmek. E294-302 tetramer kullanarak, virüs özgü T hücrelerinin beyin ve testis akış sitometresi tarafından koruma ve immunopathogenesis hücresel mekanizmaları ZIKV enfeksiyon sırasında araştırmak için izole. Bu arada, araştırmacılar CD8 fonksiyonları daha ayrıntılı araştırmaya yardımcı olur+ T hücreleri ZIKV kontrol etmek veya bu organların immunopathogenesis ZIKV enfeksiyon sırasında geliştirmek için.
Antijen spesifik fare CD8 analiz etmek için+ T hücre yanıt-e doğru immunoprivileged organlarda H-2Bb-E294-302 tetramer hazırlanan ve CD8 tespit+ T hücreleri tarafından akış sitometresi. Tetramers antijen spesifik T hücreleri tespit etmek için güçlü bir araç vardır. Burada, fluorochrome Birleşik streptavidin (APC, PE ve BV421) üç tür üretildi. APC, BV421 ve PE etiketli tetramers antijen spesifik T hücreleri, PE etiketli pMHC saptamak için hiçbir istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olsa da-ben tetramers en iyi sonuçlar vermiştir. Bu nedenle, PE etiketli tetramer bu çalışma kullanıldı. İlginçtir, PE etiketli H-2Bb-E294-302 tetramer üzerinde bağlı olarak, yüksek oranda antijen spesifik T hücrelerinin beyin ve geçiş yeteneği için kandan virüs özgü T hücrelerinin belirtmek testis tespit ettik immunoprivileged organları.
Ancak, bazı sınırlamalar Protokolü vardır. H-2Bb-E294-302 tetramer tetramer algılama MHC sınırlama üstünde bağlı olduğundan insan T-hücre algılama için kullanışlı değildir. İmmunodominant HLA-sınırlı peptidler tarama hala gereklidir. Ayrıca, retro-orbital enfeksiyonu ZIKV enfeksiyonu için etkilidir ama bazı araştırmacılar için uygun bir işlem olmayabilir. Böylece, enfeksiyon, periton, subkutan veya intravenöz, dahil olmak üzere diğer yolları da önerilir.
Burada açıklanan protokolünde monositler beyin ve testis yalıtım kritik bir adımdır. Yüksek kaliteli lenfositler elde etmek önemlidir; Bu nedenle, örneğin, radyal hız, taşlama doku gücünü ve beyin ve testis dokusu diseksiyon dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, için tetramer hazırlık, proteaz inhibitörleri (PMSF, pepstatin, leupeptin) bir protein bozulmuş üzerinden korurken yardımcı olur. Bu nedenle, bir proteaz inhibitörü refolding arabelleğe ekleyin ve arabellek tetramer hazırlama işlemi sırasında değişimi için mantıklı.
Sonuç olarak, biz Ifnar1– / – fare modeli immunoprivileged organları için bir ZIKV enfeksiyon antijen spesifik T hücreli yanıt-e doğru saptamak için yöntemler mevcut. Bu platform yaygın olarak ortaya çıkan ve virüs hangi kan ve immunoprivileged organları arasındaki engelleri atlayabilir yeniden ortaya çıkan bağışıklık mekanizmaları araştırmak için uygulanabilir. Ayrıca, bu çalışmada gelecek gelişmeye aday aşılar ve immunotherapies önünü.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Gary Wong İngilizce Gözden geçirme için teşekkür ederiz. Bu eser ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (grant 2017YFC1200202) tarafından desteklenmiştir Binbaşı özel projeler için bulaşıcı hastalık araştırma Çin (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao önde gelen bir yürütücü Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin yenilikçi araştırma grubu (grant 81621091) olduğunu.
Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
AKTA PURE | GE healthcare | ||
red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |