Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.
Guillain-바레 증후군을 선도 하 고 고환을 손상 Zika 바이러스 (ZIKV) immunoprivileged (예를 들어, 뇌와 고환), 장기에 염증을 일으킬 수 있습니다. ZIKV 감염, 동안 면역 세포 조직에 침투 하기 위해 표시 되었습니다. 그러나, ZIKV 감염 시 보호 및 이러한 면역 세포의 immunopathogenesis를 정의 하는 셀룰러 메커니즘 여전히 크게 불명 하다. 여기, 우리는 ZIKV에 감염 된 쥐의이 immunoprivileged 장기에서 바이러스 전용 T 세포 기능을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 포함 한) ZIKV 감염 및 Ifnar1/- 생쥐에서 백신 접종 b) histopathology, 면역 형광 검사, 및 뇌, 고환, 비장;에서 바이러스 감염과 염증 감지 immunohistochemistry 분석 실험 c)의 ZIKV에서 파생 된 T-세포 epitopes; tetramer의 준비 뇌, 고환, 비장에서 분리 하는 monocytes에 ZIKV 전용 T 세포의 d) 검색. Immunoprivileged 기관으로 침투 하는 항 원 특정 T 세포를 감지 하 고 감염 기간 동안이 T 세포의 기능을 평가 하는 이러한 방법을 사용 하 여,: 잠재적인 면역 보호를 통해 바이러스 정리 및 염증을 악화 또는 immunopathogenesis. 이러한 연구 결과 또한 ZIKV에 대 한 예방 접종에 의해 유도 된 T 세포의 기여를 명확히 하는 데 도움이 있습니다.
ZIKV 이다 모기 부담 flavivirus는 먼저 격리 하 1947 년에 우간다에 열 병 붉은 털 원숭이. 최근에 ZIKV 공중 보건 비상 사태를, 아메리카 및 그것의 예기치 않은 링크 microcephaly Guillain-바레 증후군1,2,3를 그것의 급속 한 보급으로 인해 되고있다. 역학 자료에서 ZIKV는 약 4, 000 당 1에 Guillain-바레 증후군의 원인을 감염 성인4의심 되었습니다. 또한, ZIKV 및 testes 감염/피해 마우스 모델 사이의 상관 관계 입증 되었습니다, ZIKV 감염의 특정 상황에서 혈액 고환 방 벽을 무시 하 고 결국 남성 불 임 증5 이어질 수 제안 . 이러한 연구 결과 ZIKV 감염 시 보호 또는 pathologic 면역 반응의 유도 완전히 이해의 중요성을 강조 표시 합니다.
많이 ZIKV에 대 한 세포 면역 응답에 대해 배울 수 있다. CD4+ 와 CD8+ T 세포 응답 capsid, 봉투, 및 nonstructural 단백질 1 (NS1) ZIKV에 감염 된 원숭이 인간6,7,8에서 관찰 되었습니다. 여러 연구에서 쥐, 표명 그 CD8+ T 세포 제어 ZIKV 복제9,,1011에 보호 역할. 중요 한 것은, 후라도 그 외 여러분 ZIKV 감염의 혈액-뇌 장벽 붕괴에 CD8의 혈관 주위 침투 결과 시연+ Ifnar1/- 생쥐 고환 내에서 효과 기 T 세포. 또한, 그들이 보여주는 CD8+ T 셀 ZIKV 관련 마비를 선동 하 고 신생아 뇌 immunopathology에서 역할을 표시. 이전 연구에서 우리는 ZIKV-E294-302 tetramer 준비 하 고 보여 그 ZIKV 전용 CD8+ T 세포는 두뇌 및 디자인에 대 한 중요 한 의미를 가질 수 있는 ZIKV 감염 Ifnar1/- 생쥐의 척수에 존재 그리고 ZIKV 백신10의 개발입니다.
ZIKV 감염을 방지 하기 위해 예방 접종에 대 한 긴급 한 필요에 대응, 여러 백신의 개발, RNA 재조합 벡터 기반 백신, 백신, 순화 된 단백질 소 단위 백신을 포함 하 여 전 임상 단계에 있습니다. 플라스 미드 DNA 백신은 단계 1 임상 시험12입니다. 안전 평가 및 ZIKV 백신의 효능은, 그러므로, 중요 하다. 백신의 장점 중 하나는 ZIKV에 대 한 보호에 대 한 중요 한 될 수 있는 특정 T 세포 응답을 유도 하는 능력입니다. ZIKV에서 파생 된 T-세포 epitope 관련 tetramers를 사용 하 여 아 데 노 바이러스 벡터 기반 ZIKV 백신에 의해 유도 된 T 세포 immunoreactivity 면역된 생쥐에서 검출 될 수 및 M과 E glycoproteins 강력한 항 원 특정 CD8 유도 표시 했다+ T-셀 immunoreactivity13.
바이러스 감염 시의 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 분자 T 세포 수용 체 (TCR)를 제시한 펩 티 드 항 원 인식 호스트14를 보호 하기 위한 중요 한 T 세포 중재 하는 메커니즘입니다. 이 이론에 따라, tetramer 기술은 항 원 특정 T 세포 면역 반응15규제에서 재생 하는 역할을 명료 하 게 하는 독특한 도구입니다. 이 프로토콜 tetramer 기술을 사용 하 여 비장, 뇌, 그리고 쥐의 고환에 반응 T 세포의 탐지 그리고 ZIKV 감염, Ifnar1-/- 마우스 모델의 설립을 설명 합니다. 또한, 우리는 감지 하 고 면역된 생쥐의 ZIKV 백신 (AdC7-M/E)에 의해 유도 된 T 세포 immunoreactivity를 평가 ZIKV-E294-302 tetramer를 사용. 이 연구 조사 기관 immunoprivileged에서에서 T 세포 응답에 대 한 지침을 제공 하 고 태 반 이나 태아 두뇌에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 참조를 제공 합니다.
면역성 T-셀 epitope 병원 체23에 대 한 세포 면역에 중요 한 역할을 한다. 따라서, immunoprivileged 장기에서 ZIKV 전용 T 세포의 검출은 자연 ZIKV 감염에 대 한 T 세포 응답을 이해 하는 중요 한 방법론 이다. 한편, T 세포 응답 감지 바이러스 백신의 효능을 조사 하는 훌륭한 도구입니다. 여기, 우리는 비장, 뇌, 그리고 ZIKV에 감염 된 마우스, immunodominant epitope E294-302 tetramer의 준비의 testes에서 림프 톨의 격리를 포함 하는 실험을 시각화 하는 포괄적인 프로토콜 표시와 ZIKV 전용 CD8의 인식+ T immunoprivileged ZIKV에 감염 된 쥐의 장기에서 세포.
이전 학문은 보여주었다 라이브 ZIKV 또는 그것의 RNA는 ZIKV 수 있습니다 혈액 고환 방 벽을 무시 하 고 생식24에서 자체 복제를 나타내는 남성 환자의 정액에서 검출 될 수 있다. 이전에, 우리도 ZIKV testes 손상 될 수 있고 쥐25에서 남성 불 임으로 이어질 보였다. ZIKV 감염으로 이어질 수 있는 붉은 털 원숭이에 니와 내장 기관 뿐만 아니라 중앙 신경 시스템 (CNS), 바이러스 성 RNA를 검출 될 수 있다. Immunohistochemistry는 CNS와 여러 주변 장기26ZIKV 특정 항 원 제시 했다 밝혔다. Murine 모델의 ZIKV 감염 강력한 항 바이러스 CD8을 일으킬 수 있다 또한,+ 비장에 CNS26T 세포 응답.
이전 작품에 비해,이 연구 ZIKV 전용 CD8 감지 체계적인 방법을 설정+ T-세포 두뇌와 고환, immunoprivileged 사이트에 응답. 그것은 ZIKV에 감염 된 쥐의 immunoprivileged 장기에서 바이러스 관련 T 세포의 기능을 평가 하는 것이 중요입니다. ZIKV 전용 CD8 감지 하는 tetramers의 사용+ T-셀 immunoprivileged 기관에 응답 ZIKV 감염 및 그들의 호스트 면역 반응에 대 한 우리의 이해를 크게 향상 시킬 것 이다. E294-302 tetramer 사용 하 여, 뇌와 고환에 바이러스 관련 T 세포 수 고립 될 cytometry에 의해 ZIKV 감염 시 보호와 immunopathogenesis의 세포 메커니즘을 조사. 한편, 연구자는 CD8 기능 추가 조사에 대 한 도움이 됩니다+ T 세포 제어 ZIKV, 또는 ZIKV 감염 시 이러한 기관에서 immunopathogenesis를 강화.
항 원 특정 murine CD8 분석+ T 세포 응답 immunoprivileged 장기에 우리는 H-2Db-E294-302 tetramer 준비 하 고는 CD8 감지 cytometry에 의해+ T 세포. Tetramers은 항 원 특정 T 세포를 감지 하는 강력한 도구입니다. 여기, 형광 색소 활용 된 streptavidin (APC, PE 및 BV421)의 세 가지 유형 생성 했다. APC-, BV421-고 항 원 특정 T 세포, PE 표시 된 pMHC을 탐지 하기 위한 tetramers PE 표시에 통계적으로 유의 한 차이가 있지만-내가 tetramers 최고의 결과 굴복. 따라서, PE 라는 tetramer이이 연구에 걸쳐 사용 되었다. 흥미롭게도, 우리 뇌와 고환에 혈액에서 바이러스 관련 T 세포의 마이그레이션 능력을 나타내는 항 원 특정 T 세포의 높은 비율을 감지 PE 표시 H-2Db-E294-302 tetramer을 바탕으로, immunoprivileged 기관입니다.
그러나, 프로토콜에 몇 가지 제한이 있습니다. H-2Db-E294-302 tetramer tetramer 탐지는 MHC 제한에 의존 하기 때문에 인간 T 세포 검출, 유용 하지 않습니다. Immunodominant HLA 제한 펩 티 드의 심사는 여전히 필요 합니다. 게다가, 역 궤도 감염 ZIKV 감염에 효과적입니다 하지만 일부 조사에 대 한 편리한 작업 수 있습니다. 따라서, 감염, 복 막, 피하, 또는 정 맥를 포함 하 여 다른 경로 또한 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 프로토콜에서 중요 한 단계는 두뇌와 고환에서 monocytes의 격리입니다. 높은-품질 림프 톨; 취득 하는 것이 중요 하다 따라서, 예를 들어 원심 속도, 연 삭 조직의 힘과 두뇌와 고환 조직의 해 부에 관심을 지불 하는 것이 중요 하다. 게다가, tetramer 준비에 대 한 protease 억제제 (PMSF, pepstatin, leupeptin)는 도움이 타락에서 단백질을 보호 하는 경우. 따라서, 그것을 추가 하는 프로 테아 제 억제제 refolding 버퍼 고 tetramer 준비의 과정에서 버퍼를 교환 의미가 있습니다.
결론적으로, 우리는 ZIKV 감염에 대 한 Ifnar1-/- 마우스 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 검출 하는 방법 제시. 이 플랫폼 신흥 고 다시 신흥 혈액 및 immunoprivileged 기관 사이의 장벽을 우회할 수 있는 바이러스의 면역 메커니즘을 조사를 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 또한,이 연구 후보 백신과 immunotherapies의 미래 발전에 대 한 방법을 포장 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 영어 버전에 대 한 게리 왕 감사합니다. 이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (그랜트 2017YFC1200202)에 의해 지원 되었다 (그랜트 2016ZX10004222-003) 중국 연구 전염 성 질병에 대 한 주요 특별 프로젝트. 조지 F. Gao는 국가 자연 과학 재단의 중국 혁신적인 연구 그룹 (그랜트 81621091)의 주요 책임자 이다.
Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
AKTA PURE | GE healthcare | ||
red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |