本文介绍了一种评估 Ifnar1–小鼠寨卡病毒 (ZIKV) 感染 immunoprivileged 器官抗原特异 T 细胞反应的协议。该方法对 ZIKV 疫苗的保护和免疫发病机制细胞机制的研究具有重要意义, 对其疗效评价也有参考价值。
寨卡病毒 (ZIKV) 可以诱导 immunoprivileged 器官 (如大脑和睾丸) 发炎, 导致格林-–巴雷综合征和损害睾丸。在感染 ZIKV, 免疫细胞已经被证明渗入到组织。然而, 在 ZIKV 感染期间定义这些免疫细胞的保护和/或免疫发病机制的细胞机制仍在很大程度上是未知的。本文介绍了 ZIKV 感染小鼠 immunoprivileged 器官中病毒特异 T 细胞功能的评估方法。这些方法包括 a) ZIKV 感染和 Ifnar1 小鼠接种疫苗 ;b) 组织病理学、免疫荧光和免疫组化检测, 检测脑、睾丸和脾脏中的病毒感染和炎症;c) 四聚体 ZIKV T 细胞表位的制备;d) 检测从大脑、睾丸和脾脏分离的单核细胞中的 ZIKV 特异 T 细胞。使用这些方法, 可以检测到 immunoprivileged 器官中的抗原特异 t 细胞, 并评估这些 t 细胞在感染过程中的功能:通过病毒清除的潜在免疫保护和/或免疫发病机制加重炎症。这些发现也有助于澄清免疫对 ZIKV 的 T 细胞的贡献。
ZIKV 是一种蚊媒黄病毒, 在1947年在乌干达从一只热猕猴中分离出来。最近, 由于其在美洲的迅速传播及其与小头症和格林-–巴雷综合征1、2、3的意外联系, ZIKV 已成为公共卫生紧急情况。从流行病学数据, ZIKV 被怀疑是格林-–巴雷综合征的原因在大约1每4000受感染的成人4。此外, ZIKV 与睾丸感染/损伤之间的相关性已被证明, 表明 ZIKV 感染, 在某些情况下, 可以绕过血睾丸屏障, 最终导致男性不育5.这些发现强调了完全理解在 ZIKV 感染期间诱导保护性或病理性免疫反应的重要性。
对 ZIKV 的细胞免疫反应还有很多要了解。CD4+和 CD8+ T 细胞对衣壳、包络和非结构蛋白 1 (NS1) 的反应在 ZIKV 感染的猴子和人类中观察到6,7,8。在小鼠中, 一些研究表明 CD8+ T 细胞在控制 ZIKV 复制9、10、11方面起着保护作用。重要的是, Jurado et 等表明, ZIKV 感染导致血脑屏障的击穿和 CD8+效应 T 细胞在 Ifnar1/小鼠睾丸内的血管周围浸润。此外, 他们表明, CD8+ T 细胞挑起 ZIKV 相关的瘫痪, 似乎在新生儿大脑免疫病理学发挥作用。在前一项研究中, 我们准备了 ZIKV294-302四聚体, 并表明 ZIKV 特定的 CD8+ T 细胞存在于 ZIKV 感染的 Ifnar1 小鼠的大脑和脊髓中, 这可能对设计有重要影响。和开发 ZIKV 疫苗10。
针对预防 ZIKV 感染的迫切需要, 一些疫苗处于开发的临床前阶段, 包括 RNA 疫苗、基于重组载体的疫苗和纯化的蛋白亚基疫苗。质粒 DNA 疫苗是在1阶段临床试验12。因此, 评估 ZIKV 疫苗的安全性和功效是非常重要的。疫苗的一个优点是它们能够诱发特定的 T 细胞反应, 这对于保护 ZIKV 是很重要的。利用 ZIKV 衍生的 t 细胞表位相关四聚体, 可在免疫小鼠中检测到腺病毒载体 ZIKV 疫苗诱导的 t 细胞免疫反应, 并显示 M 和 E 糖蛋白诱导出强健的抗原特异性 CD8+T 细胞免疫反应13。
在病毒感染过程中, 主要组织相容性复合物 (MHC) 分子对 t 细胞受体 (TCR) 的多肽抗原的识别是保护宿主14的重要 T 细胞介导机制。基于这一理论, 四聚体技术是一个独特的工具, 以阐明抗原特异 T 细胞在调节免疫反应中发挥的作用15。本协议描述了 ZIKV 感染的 Ifnar1小鼠模型的建立, 以及利用四聚体技术检测小鼠脾脏、脑和睾丸中的反应性 T 细胞。此外, 我们使用 ZIKV294-302四聚体检测和评价免疫小鼠 ZIKV 疫苗 (AdC7-M/E) 诱导的 T 细胞免疫反应。本研究为调查 immunoprivileged 器官中的 T 细胞反应提供指导, 并为胎盘或胎儿脑的潜在应用提供参考。
免疫原性 T 细胞表位在细胞免疫中起重要作用23。因此, 检测 immunoprivileged 器官中的 ZIKV 特异 t 细胞是了解 t 细胞对自然 ZIKV 感染的反应的关键方法。同时, T 细胞反应检测是研究病毒疫苗疗效的绝佳工具。在这里, 我们展示了一个全面的协议, 以可视化实验, 其中包括从脾脏, 大脑和睾丸的 ZIKV 感染小鼠的淋巴细胞的分离, 免疫显性表位 E294-302四聚体的制备和ZIKV 感染小鼠 immunoprivileged 器官中 ZIKV 特异 CD8+ T 细胞的识别。
前一项研究表明, 在男性患者的精子中可以检测到活体 ZIKV 或 RNA, 这表明 ZIKV 可以绕过血睾丸屏障, 并在生殖系统24中复制自身。之前, 我们还表明, ZIKV 可能导致睾丸损害, 导致男性不育的小鼠25。ZIKV 感染可导致恒河猴病毒血症, 病毒 RNA 可在中枢神经系统 (CNS) 以及内脏器官中检测到。免疫组化显示, ZIKV 特异抗原在中枢神经系统和多外周器官中呈现26。此外, 在小鼠模型中, ZIKV 感染可以诱导脾脏和中枢神经系统26中的抗病毒 CD8+ T 细胞反应。
与以前的工作相比, 本研究建立了系统的方法来检测 ZIKV 特异 CD8+ T 细胞反应在大脑和睾丸, 这是 immunoprivileged 的网站。评估 ZIKV 感染小鼠 immunoprivileged 器官中特定于病毒的 T 细胞的功能是非常重要的。使用四聚体检测 immunoprivileged 器官中 ZIKV 特异的 CD8+ T 细胞反应, 将大大提高我们对 ZIKV 感染及其宿主免疫反应的了解。使用 E294-302四聚体, 脑和睾丸中的病毒特异 T 细胞可以通过流式细胞术分离, 研究 ZIKV 感染期间保护和免疫发病机制的细胞机制。同时, 进一步深入研究 CD8+ T 细胞对 ZIKV 的控制作用, 或在 ZIKV 感染中增强免疫发病机制。
为了分析 immunoprivileged 器官中抗原特异的小鼠 CD8+ t 细胞反应, 我们制备了 H-2D294-302四聚体, 并通过流式细胞仪检测了 CD8+ t 细胞.四聚体是检测抗原特异 T 细胞的强大工具。在这里, 产生了三种类型的荧光染料共轭链霉素 (APC, PE 和 BV421)。虽然在检测抗原特异 T 细胞的 APC、BV421 和 pe 标记四聚体中没有统计学上的显著差异, 但 pe 标记的 pMHC 四聚体产生了最佳结果。因此, 在整个研究中使用了 PE 标记的四聚体。有趣的是, 基于 PE 标记的 H-2DbE294-302四聚体, 我们检测到在大脑和睾丸中抗原特异 t 细胞的高比例, 这表明病毒特异 t 细胞从血液的迁移能力immunoprivileged 器官。
但是, 该协议有一些限制。H-2D 294-302四聚体对人 T 细胞检测没有用处, 因为四聚体检测依赖 MHC 限制。免疫显性 HLA 限制性肽的筛选仍然需要。此外, 复古轨道感染是有效的 ZIKV 感染, 但可能不是一个方便的手术为一些调查人员。因此, 还建议其他感染途径, 包括腹膜、皮下或静脉注射。
在这里描述的协议中, 一个关键步骤是从大脑和睾丸中分离单核细胞。获得高质量的淋巴细胞是很重要的;因此, 重要的是要注意, 例如, 离心速度, 研磨组织的强度, 和大脑和睾丸组织的解剖。此外, 对于四聚体制剂, 蛋白酶抑制剂 (PMSF, pepstatin, 亮) 在保护蛋白质不被降解时很有帮助。因此, 将蛋白酶抑制剂添加到复用缓冲液中并在四聚体制备过程中交换缓冲液是有意义的。
最后, 我们提出了在 ZIKV 感染的 Ifnar1 小鼠模型 immunoprivileged 器官中检测抗原特异 T 细胞反应的方法。该平台可广泛应用于研究新出现的和重新出现的病毒的免疫机制, 可以绕过血液和 immunoprivileged 器官之间的屏障。此外, 这项研究可能为候选疫苗和免疫疗法的未来发展铺平道路。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢黄议员的英语修订。这项工作得到了中国国家重点研究和发展计划 (赠款 2017YFC1200202) 的支持, 这是中国传染性疾病研究的主要专项项目 (赠款 2016ZX10004222-003)。乔治 f. 高是中国创新研究集团国家自然科学基金 (赠款 81621091) 的主要研究员。
Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
AKTA PURE | GE healthcare | ||
red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |