Se describe un protocolo para evaluar las respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1– / – modelo murino para la infección del virus (ZIKV) Zika. Este método es fundamental para la investigación de los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis de las vacunas ZIKV y también es valiosa para la evaluación de su eficacia.
El virus Zika (ZIKV) puede inducir inflamación en órganos de immunoprivileged (p. ej., el cerebro y los testículos), llevando al síndrome de Guillain-Barré y dañar los testículos. Durante una infección con el ZIKV, han demostrado las células inmunes para infiltrarse en los tejidos. Sin embargo, los mecanismos celulares que definen la protección o la inmunopatogénesis de estas células inmunitarias durante una infección ZIKV son todavía en gran parte desconocidos. Adjunto, describimos los métodos para evaluar la funcionalidad del T-cell de virus específicos en estos immunoprivileged órganos de ratones infectados por ZIKV. Estos métodos incluyen una) una infección ZIKV e inoculación de la vacuna en Ifnar1 ratones de– / – ; b) histopatología, inmunofluorescencia y pruebas de inmunohistoquímica para detectar el virus de la infección y la inflamación en el cerebro, los testículos y bazo; c) la preparación de un tetrámero de epitopos del T-cell ZIKV derivados; d) la detección de células T específicas ZIKV en los monocitos aislados del cerebro, los testículos y bazo. Utilizando estos enfoques, es posible detectar las células de T específicas de antígeno infiltrados en los órganos immunoprivileged y evaluar las funciones de estas células T durante la infección: potencial protección inmune vía virus separación y inmunopatogénesis de y/o exacerbar la inflamación. Estos hallazgos también pueden ayudar a aclarar la contribución de las células T inducida por la vacunación contra ZIKV.
El ZIKV es un flavivirus transmitido por mosquitos que se aisló por primera vez en 1947 en Uganda de un macaco rhesus febril. Recientemente, el ZIKV se ha convertido en una emergencia de salud pública, debido a su rápida difusión en las Américas y su inesperada relación con microcefalia y síndrome de Guillain-Barré síndrome1,2,3. De datos epidemiológicos, la ZIKV ha sido sospechado ser la causa del síndrome de Guillain-Barré en alrededor 1 por 4.000 infectados adultos4. Además, una correlación entre el daño infección ZIKV y testículos en el modelo de ratón se ha demostrado, lo que sugiere que la infección por ZIKV, bajo ciertas circunstancias, puede saltarse la barrera del sangre-testis y eventualmente conducir a la infertilidad masculina5 . Estos resultados destacan la importancia de entender completamente la inducción de respuestas inmunes protectoras o patológicas durante una infección ZIKV.
Queda mucho por aprender acerca de las inmunorespuestas celulares a la ZIKV. CD4+ y CD8+ T-cell responses to la cápside, envoltura y proteína no estructural 1 (NS1) se han observado en infectados por ZIKV monos y seres humanos6,7,8. En ratones, varios estudios han indicado que CD8+ T las células juegan un papel protector en el control de la replicación de ZIKV9,10,11. Lo importante, Jurado et al demostró que una infección ZIKV resulta en la ruptura de la barrera hemato – encefálica y la infiltración perivascularia de CD8+ células efectoras T dentro de los testículos de ratones– / – Ifnar1. Además, demostró que CD8+ T células propiciar parálisis asociadas ZIKV y parecen jugar un papel en el immunopathology del cerebro neonatal. En un estudio anterior, preparamos el tetrámero de294-302 ZIKV-E y demostró que CD8 específicas ZIKV+ T las células existen en los cerebros y médulas espinales de los ratones– / – Ifnar1 ZIKV infectados, que pueden tener importantes implicaciones para el diseño y desarrollo de ZIKV vacunas10.
En respuesta a la necesidad urgente de vacunación para prevenir la infección por ZIKV, varias vacunas están en la fase preclínica de desarrollo, incluyendo vacunas, vacunas basadas en vectores recombinantes y vacunas de subunidades de la proteína purificada de RNA. La vacuna de ADN de plásmido está en fase 1 ensayos clínicos12. La evaluación de la seguridad y eficacia de las vacunas ZIKV es, por lo tanto, importantes. Una de las ventajas de las vacunas es su capacidad para obtener respuestas específicas del T-cell, que pueden ser importantes para la protección contra la ZIKV. Mediante el uso de tetrámeros de ZIKV T-células relacionadas con el epitopo, pudo detectarse el immunoreactivity de células T inducido por una vacuna ZIKV adenovirus vector basado en ratones inmunizados y glicoproteínas de M y E se demostró que inducen fuerte específica de antígeno CD8+ T-cell immunoreactivity13.
Durante una infección de virus, el reconocimiento de antígenos péptidos presentados por las moléculas de (MHC) complejo mayor de histocompatibilidad para el receptor de células T (TCR) es un mecanismo importante de mediada por células T para la protección de host14. Basado en esta teoría, tetrámero tecnología es una herramienta única para aclarar los roles que juegan las células T antígeno específicas en la regulación de la respuesta inmune15. Este protocolo describe el establecimiento del Ifnar1– / – modelo de ratón para las infecciones ZIKV y la detección de las células T reactivas en el bazo, cerebro y testículos de los ratones mediante el uso de tecnología de tetrámero. Además, utilizamos el tetrámero de294-302 ZIKV-E para detectar y evaluar immunoreactivity de células T inducido por una vacuna ZIKV (AdC7-M/E) en los ratones inmunizados. Este estudio proporciona una guía para la investigación de las respuestas de células T en immunoprivileged órganos y proporciona una referencia para las aplicaciones potenciales en la placenta o cerebro fetal.
Inmunogénica epitopo de célula de T juega un papel importante en inmunidad celular contra patógenos23. Así, la detección de células T específicas ZIKV en órganos immunoprivileged es una metodología crítica para entender las respuestas de células T contra la infección natural por ZIKV. Mientras tanto, la detección de la respuesta de células T es una excelente herramienta para investigar la eficacia de la vacuna viral. A continuación, os mostramos un protocolo integral para visualizar los experimentos, que incluyen el aislamiento de los linfocitos del bazo, cerebro y testículos de ratones infectados por ZIKV, la preparación de la inmunodominante del epítopo E294-302 tetrámero y la reconocimiento de CD8 específicas ZIKV+ T las células en los órganos de ratones infectados por ZIKV immunoprivileged.
Un estudio anterior demostró que puede detectarse un ZIKV vivo o su ARN en el semen de pacientes masculinos, que indica que el ZIKV puede saltarse la barrera del sangre-testis y replicar a sí mismo en el sistema reproductivo24. Previamente, demostramos que el ZIKV puede dañar los testículos y conducen a la infertilidad masculina en ratones25. ZIKV infección puede conducir a viremia en monos rhesus, y el ARN viral puede ser detectado en el sistema nervioso central (SNC), así como en los órganos viscerales. Immunohistochemistry reveló que antígenos específicos ZIKV se presentaron en el SNC y órganos periféricos múltiples26. También, en modelos murinos, infección por ZIKV puede inducir un robusto antivirus CD8+ respuesta de la célula de T en el bazo y el CNS26.
En comparación con trabajos anteriores, este estudio establece métodos sistemáticos para la detección específica ZIKV CD8+ T-cell las respuestas en el cerebro y los testículos, que son sitios de immunoprivileged. Es importante evaluar la funcionalidad de las células en los órganos de immunoprivileged de los ratones infectados por ZIKV virus-específica. El uso de tetrámeros para detectar CD8 específicas ZIKV+ T-cell respuestas en órganos immunoprivileged mejoraría grandemente nuestra comprensión de las infecciones ZIKV y sus anfitrión inmunorespuestas. Usando el tetrámero de294-302 E, virus específicos de células T en cerebro y testículos pueden aislarse mediante citometría de flujo, para investigar los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis durante una infección ZIKV. Mientras tanto, es útil para los investigadores investigar más a fondo las funciones de los CD8+ T de las células para controlar el ZIKV, o para mejorar la inmunopatogénesis en estos órganos durante la infección ZIKV.
Para analizar el CD8 murino específica de antígeno+ T-cell las respuestas en los órganos immunoprivileged, preparamos tetrámero de294-302 – E H-2Dby detectado el CD8+ T las células mediante citometría de flujo. Tetrámeros son una poderosa herramienta para detectar células de T específicas de antígeno. Aquí, se generaron tres tipos de fluorocromo conjugado estreptavidina (APC, el PE y BV421). Aunque no hay diferencias estadísticamente significativas en la APC, BV421 y tetrámeros marcado con PE para la detección de antígenos específicos de células T, pMHC marcado con PE-I tetrámeros rindieron los mejores resultados. Por lo tanto, el tetrámero marcado con PE se utilizó en este estudio. Curiosamente, en el tetrámero de294-302 – E marcado con PE H-2Dbbase, detectamos proporciones elevadas de linfocitos T antígeno específicos en el cerebro y los testículos, que indican la capacidad de migración de las células de T del virus-específica de la sangre a órganos de immunoprivileged.
Sin embargo, existen algunas limitaciones en el protocolo. El tetrámero de294-302 – E H-2Dbno es útil para la detección de células T humana, porque detección tetrámero es dependiente sobre restricción de MHC. La investigación de péptidos HLA restringida inmunodominante es necesario. Además, retro-orbital infección es eficaz para una infección por ZIKV pero podría no ser una operación conveniente para algunos investigadores. Así, otras vías de infección, incluyendo peritoneal, subcutánea o intravenosa, se recomiendan también.
En el protocolo descrito aquí, un paso fundamental es el aislamiento de monocitos de cerebro y testículos. Es importante adquirir alta calidad linfocitos; por lo tanto, es importante prestar atención a, por ejemplo, la velocidad centrífuga, la fuerza del tejido pulido y la disección de los tejidos del cerebro y testículos. Además, para la preparación de tetrámero, inhibidores de la proteasa (PMSF, pepstatin, leupeptin) son útiles cuando protege la degradación de una proteína. Por lo tanto, tiene sentido añadir un inhibidor de proteasa en el búfer de repliegue y cambiar el búfer durante el proceso de la preparación del tetrámero.
En conclusión, presentamos los métodos de detectar respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1– / – modelo de ratón para una infección por ZIKV. Esta plataforma puede ser ampliamente aplicada para investigar los mecanismos inmunes de emergentes y re-emergentes virus que pueden saltarse las barreras entre la sangre y los órganos immunoprivileged. Por otra parte, este estudio puede allanar el camino para el futuro desarrollo de candidatas a vacunas e inmunoterapias.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen la revisión inglés Gary Wong. Este trabajo fue apoyado por la investigación clave y programa de desarrollo de China (grant 2017YFC1200202), la mayor de proyectos especiales para enfermedades infecciosas investigación de China (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao es un investigador líder la nacional Ciencias naturales Fundación de China innovadora del grupo de investigación (grant 81621091).
Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
AKTA PURE | GE healthcare | ||
red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |