Um protocolo para avaliar as respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1– / – modelo murino para a infecção de vírus (ZIKV) Zika é descrito. Este método é essencial para investigar os mecanismos celulares da proteção e imunopatogênese das vacinas ZIKV e também é valioso para sua avaliação de eficácia.
O vírus Zika (ZIKV) podem induzir inflamação nos órgãos de immunoprivileged (por exemplo, o cérebro e os testículos), levando à síndrome de Guillain-Barré e danificar os testículos. Durante uma infecção com a ZIKV, as células imunes foram mostradas para se infiltrar nos tecidos. No entanto, os mecanismos celulares que definem a proteção e/ou imunopatogênese dessas células imunes durante uma infecção ZIKV ainda são em grande parte desconhecidos. Aqui, descrevemos os métodos para avaliar a funcionalidade de células T do vírus específicos nesses órgãos immunoprivileged de camundongos infectados com ZIKV. Estes métodos incluem um) uma infecção ZIKV e inoculação da vacina em Ifnar1– / – ratos; b) histopatologia, imunofluorescência e ensaios de imuno-histoquímica para detectar o vírus infecção e inflamação no cérebro, testículos e baço; c) a preparação de um tetrâmero de epitopos de célula T ZIKV-derivado; d) a detecção de células T ZIKV específicos nos monócitos isoladas do cérebro, baço e testículos. Usando essas abordagens, é possível detectar as células T antígeno-específicas que infiltraram-se os órgãos immunoprivileged e avaliar as funções destas células T durante a infecção: potencial proteção imune através de vírus apuramento e / ou imunopatogênese para exacerbar a inflamação. Esses achados também podem ajudar a esclarecer a contribuição das células T induzida pela imunização contra ZIKV.
O ZIKV é um flavivirus transmitidas por mosquitos que foi primeiramente isolado em 1947 em Uganda de um macaco rhesus febril. Recentemente, o ZIKV tornou-se uma emergência de saúde pública, devido à sua rápida disseminação nas Américas e sua ligação inesperada com microcefalia e síndrome de Guillain-Barré a1,2,3. De dados epidemiológicos, o ZIKV tem sido suspeita ser a causa da síndrome de Guillain-Barré em cerca de 1 por 4.000 infectados adultos4. Além disso, uma correlação entre a infecção e danos ZIKV e testículos no modelo do rato foi demonstrada, sugerindo que a infecção de ZIKV, em determinadas circunstâncias, pode ultrapassar a barreira de sangue-testículo e eventualmente levar à infertilidade masculina5 . Estas descobertas destacam a importância de compreender completamente a indução de proteção ou patológicas respostas imunes durante uma infecção ZIKV.
Há ainda muito para ser aprendido sobre as respostas imunológicas celulares para o ZIKV. CD4+ e CD8+ T-cell responses to o capsídeo, envelope e proteínas nonstructural 1 (NS1) têm sido observadas em infectados ZIKV macacos e humanos6,7,8. Em camundongos, vários estudos têm indicado que CD8+ T células desempenham um papel protetor no controle do ZIKV replicação9,10,11. Importante, o Jurado et al demonstraram que uma infecção ZIKV resulta na degradação da barreira hemato – encefálica e infiltração perivascular de CD8+ células efetoras T dentro os testículos de Ifnar1– / – ratos. Além disso, eles mostraram que CD8+ T células instigar paralisia associada ZIKV e parecem desempenhar um papel na Imunopatologia cérebro neonatal. Em um estudo anterior, temos preparado o tetrâmero de294-302 ZIKV-E e mostrou aquele CD8 específicas ZIKV+ T existem células no cérebro e espinais de ZIKV infectados Ifnar1– / – ratos, que podem ter implicações importantes para o design e desenvolvimento de vacinas ZIKV10.
Em resposta à necessidade urgente de vacinação prevenir a infecção ZIKV, várias vacinas estão em fase pré-clínica de desenvolvimento, incluindo o RNA vacinas, vacinas recombinantes baseadas em vetor e vacinas de subunidade de proteína purificada. A vacina de DNA plasmídeo está em fase de ensaios clínicos 112. A avaliação da segurança e eficácia das vacinas ZIKV é, portanto, importantes. Uma vantagem das vacinas é sua capacidade de eliciar respostas de células T específicas, que podem ser importantes para a proteção contra o ZIKV. Usando tetrâmeros de epítopo-relacionados ZIKV-derivado de célula T, a imunorreatividade de células T induzida por uma vacina ZIKV baseado em vetor de adenovírus poderia ser detectada em camundongos imunizados, e M e E glicoproteínas foram mostradas para induzir robusto antígeno-específicos CD8+ Células T imunorreatividade13.
Durante uma infecção de vírus, o reconhecimento de antígenos de peptídeo apresentado por moléculas de histocompatibilidade (MHC) complexas do receptor de células T (TCR) é um importante mecanismo de mediada por células-T, para proteger o hospedeiro de14. Com base nesta teoria, o tetrâmero tecnologia é uma ferramenta única para elucidar as funções que as células T antígeno-específicas jogam na regulação das respostas imunes15. Este protocolo descreve a criação do Ifnar1– / – rato modelo para infecções ZIKV e a detecção de células T reativas o baço, cérebro e testículos dos ratos usando tecnologia tetrâmero. Além disso, usamos o tetrâmero de294-302 ZIKV-E para detectar e avaliar imunorreatividade de células T induzida por uma vacina ZIKV (AdC7-M/E) em camundongos imunizados. Este estudo fornece orientação para investigar respostas de células T em órgãos immunoprivileged e fornece uma referência para as aplicações potenciais na placenta ou no cérebro fetal.
Epítopo de célula T imunogênico desempenha um papel importante na imunidade celular contra patógenos23. Assim, a detecção de células T ZIKV específicos em órgãos immunoprivileged é uma metodologia crítica para compreender as respostas de células T contra a infecção natural de ZIKV. Entretanto, a detecção de resposta de células T é uma excelente ferramenta para investigar a eficácia da vacina viral. Aqui, nós mostramos um protocolo abrangente para visualizar as experiências, que incluem o isolamento de linfócitos de baço, cérebro e testículos de ratos infectados com ZIKV, a preparação do imunodominantes epítopo E294-302 tetrâmero e o reconhecimento de CD8 específicas ZIKV+ T células em órgãos immunoprivileged de camundongos infectados com ZIKV.
Um estudo anterior mostrou que um ZIKV ao vivo ou seu RNA pode ser detectado no sêmen de pacientes do sexo masculino, que indica que o ZIKV pode ultrapassar a barreira de sangue-testículo e se replicar no sistema reprodutivo de24. Anteriormente, nós também mostrou que a ZIKV pode causar danos de testículos e levar à infertilidade masculina em ratos25. Infecção ZIKV pode levar a virémia no macaco rhesus, e o RNA viral pode ser detectado no sistema nervoso central (SNC), bem como nos órgãos viscerais. Imuno-histoquímica revelou que antígenos específicos ZIKV foram apresentados no CNS e os vários órgãos periféricos26. Também, em modelos murino, infecção ZIKV pode induzir um robusto CD8 antiviral+ resposta de células T no baço e no CNS26.
Comparado aos trabalhos anteriores, este estudo estabelece métodos sistemáticos para detectar CD8 específicas ZIKV+ células T respostas do cérebro e os testículos, que são sites de immunoprivileged. É importante avaliar a funcionalidade de células T de vírus específicos nos órgãos dos ratos infectados com ZIKV immunoprivileged. O uso de tetrâmeros para detectar CD8 específicas ZIKV+ células T respostas em órgãos immunoprivileged iria aumentar consideravelmente a nossa compreensão de infecções ZIKV e suas respostas imunes do anfitrião. Usando o tetrâmero de294-302 E, as células T vírus específicos no cérebro e testículo podem ser isoladas por citometria de fluxo, para investigar os mecanismos celulares de proteção e imunopatogênese durante uma infecção ZIKV. Entretanto, é útil para pesquisadores investigar mais profundamente as funções do CD8+ T células para controlar o ZIKV, ou para realçar a imunopatogênese nesses órgãos durante a infecção ZIKV.
Para analisar o CD8 murino antígeno-específicas+ células T respostas nos órgãos immunoprivileged, estamos preparados tetrâmero de294-302 – E H-2Dbe detectado o CD8+ T células por citometria de fluxo. Tetrâmeros são uma poderosa ferramenta para detectar as células T antígeno-específicas. Aqui, três tipos de estreptavidina conjugada com fluorocromo (APC, PE e BV421) foram gerados. Embora existam sem diferenças estatisticamente significativas na APC-, BV421-e PE-rotulado tetrâmeros para a detecção de células T antígeno-específicas pMHC PE-rotulados-eu tetrâmeros renderam os melhores resultados. Daí, o tetrâmero PE-etiquetado foi utilizado ao longo deste estudo. Curiosamente, baseia o tetrâmero de294-302 – E H-2D PE-etiquetadob, detectamos elevados rácios das células T antígeno-específicas no cérebro e os testículos, que indicam a capacidade de migração das células T do sangue para vírus específicos immunoprivileged órgãos.
No entanto, existem algumas limitações para o protocolo. O tetrâmero de294-302 – E H-2Dbnão é útil para a deteção de células T humana, porque tetrâmero detecção é dependente de restrição MHC. O rastreio de peptídeos imunodominantes de HLA-restrito ainda é necessária. Além disso, infecção retrô-orbital é eficaz para uma infecção ZIKV… mas pode não ser uma operação conveniente para alguns investigadores. Assim, outras vias de infecção, incluindo peritoneal, subcutânea ou intravenosa, também são recomendadas.
O protocolo descrito aqui, um passo fundamental é o isolamento de monócitos do cérebro e testículos. É importante adquirir a qualidade de linfócitos; assim, é importante prestar atenção, por exemplo, a velocidade centrífuga, a força do tecido moagem e a dissecação do tecido cerebral e testículo. Além disso, para a preparação de tetrâmero, inibidores de protease (PMSF, pepstatin, leupeptin) são úteis quando protegendo uma proteína a ser degradada. Portanto, faz sentido adicionar um inibidor de protease para o buffer de redobramento e trocar o buffer durante o processo de preparação do tetrâmero.
Em conclusão, apresentamos os métodos de detecção de respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1– / – modelo do rato para uma infecção ZIKV. Esta plataforma pode ser amplamente aplicada para investigar os mecanismos imunes de emergentes e re-emergentes vírus que podem ignorar as barreiras entre o sangue e os órgãos de immunoprivileged. Além disso, este estudo pode pavimentar o caminho para o futuro desenvolvimento de vacinas do candidato e imunoterapias.
The authors have nothing to disclose.
Os autores Agradecemos a revisão inglês Gary Wong. Este trabalho foi financiado pelo National Research chave e programa de desenvolvimento da China (concessão 2017YFC1200202), os projetos especiais de Major para infecciosa doença pesquisa da China (concessão 2016ZX10004222-003). George F. Gao é um investigador principal líder do nacional ciências naturais Fundação de China inovador grupo de pesquisa (grant 81621091).
Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
AKTA PURE | GE healthcare | ||
red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |