Здесь мы представляем протокол для живых клеток изображений сигнальной деятельности TGF-β/Smad3 с помощью системы репортер аденовируса. Эта система отслеживает транскрипционный анализ активности в режиме реального времени и может быть применен как отдельные клетки в пробирке и в живых животныхмодели.
Преобразование сигнализации фактор роста β (TGF-β) регулирует многие важные функции, необходимые для клеточного гомеостаза и обычно встречаются оверэкспрессировали во многих заболеваний, включая рак. TGF-β сильно вовлечен в метастазов во время поздней стадии рака прогрессии, активация подмножество мигрирующих и инвазивные опухолевых клеток. Текущие методы для сигнализации путь анализа сосредоточены на конечной модели, которые часто пытаются измерить сигнализации пост hoc биологических события и не отражает прогрессивный характер болезни. Здесь мы демонстрируем конкретного системы Роман аденовирус репортер на сигнальный путь TGF-β/Smad3, который может обнаружить transcriptional активации в живых клетках. Использование Ad-CAGA12-Td-том репортер, мы можем достичь 100% заболеваемости MDA-MB-231 клеток в течение 24 ч в пробирке. Использование флуоресцентных репортер позволяет для изображений живой одиночных камер в режиме реального времени с прямой идентификации транскрипционно активных клеток. Стимуляция зараженных клеток с TGF-β отображается только подмножество ячеек, которые транскрипционно активны и участвовать в конкретных биологических функций. Этот подход позволяет высокая специфичность и чувствительность на уровне одной ячейки для улучшения понимания биологических функций, связанных с TGF-β сигнализации, в пробирке. Smad3, транскрипционный анализ деятельности также может быть сообщено в естественных условиях в режиме реального времени через применение Ad-CAGA12– Люк репортер. Ad-CAGA12– Люк может быть измерена в так же, как традиционные стабильно transfected Люцифераза клеточных линий. Smad3 транскрипционный анализ активности клеток имплантированных в естественных условиях можно проанализированы через обычные ИВИС изображений и контролировать жить во время прогрессии опухоли, предоставляя уникальную возможность заглянуть в динамике TGF-β сигнальный путь. Наш протокол описывает систему доставки выгодно репортер позволяет для быстрой визуализации высок объём живой клетки, сигнальные пути в пробирке и в естественных условиях. Этот метод может быть расширен спектр изображения на основе анализов и представляет как чувствительных и воспроизводимый подход для базовой биологии и терапевтические развития.
Трансформирующий фактор роста β (TGF-β) является важным цитокина, замешанных в развитии человеческого потенциала, что сигналы через гетеродимерная комплекс, состоящий из типа II и I типа рецепторов1. Привязка к типу II рецепторов приводит к вербовки и фосфорилирование типа я рецептор, который в свою очередь фосфорилирует вниз по течению Smad2/3 белки2,3. Эти активирован Smad2/3 белки привязку к Smad4, образуя комплекс, который translocates в ядро и регулирует транскрипцию генов4. В условиях гомеостатических TGF-β/Smad сигнализации жестко регулируется; Однако во многих заболеваний, сигнальный путь является дерегулирование и часто оверэкспрессировали ведет к прогрессированию заболевания5,6,7. Недавние исследования показали, что клеточный ответ на TGF-β разнородные и субпопуляций TGF-β/Smad активные клетки отвечают за биологические функции в обнаруживавшие время8,9. Общий анализ клеточных TGF-β/Smad сигнализации включает в себя использование фиксированной конечной точки анализов, которые предоставляют только снимок клеточную активность и часто quantitate средний эффект TGF-β/Smad10. Однако, эти методы не могут точно представлять молекулярных поведения TGF-β/Smad сигнализации в физиологическом состоянии во время болезни. Анализ на основе изображений живых клеток захватить динамику клеточного и биологических процессов с пространственной и временной понимания.
Нашей целью было разработать чувствительный метод высокой пропускной способностью для живых клеток изображений TGF-β/Smad сигнализацию с помощью реагентов на основе аденовирусы. Здесь мы заражены линии клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 аденовирус, выражая Smad3 CAGA мотив привязки последовательности и Люцифераза (Люк) или Td-томатный (Td-Tom) Репортер ген. Аденовирусных репортер системы обеспечивают быстрый и дешевый метод для плазмида введение, которое может привести к инфекции 100% показатель в рак клеточных линий. Аденовирусных репортер системы также были успешно применены к клеточных линий, которые трудно transfect с обычными плазмида11. В этом протоколе мы будем описывать воспроизводимость и неинвазивной процесс для достижения живой клетки изображений TGFβ/Smad сигнальный путь как в естественных условиях , так и в пробирке.
Мы разработали технику для в реальном времени изображений TGF-β/Smad3 сигнализации в одном живых клеток. Используя этот новый метод, мы ранее определили суб популяция клеток с динамичной деятельности transcriptional TGF-β/Smad3, который был связан с расширенной вторжения и миграции8. Этот …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана субсидии от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) H-JZ. TMBW является получателем Австралии аспирантов награду от правительства Австралии и Энн Хендерсон Top-Up стипендию от здравоохранения Австралии Ротари в партнере с Ротари Templestowe и пообедать на излечение.
DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
Luminometer | Promega | 9100-002 | |
Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
Solution | Composition | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |