نقدم هنا، بروتوكولا لتصوير الخلية الحية TGF-β/Smad3 مما يشير إلى النشاط باستخدام نظام مراسل إتش. هذا النظام تعقب النشاط الترانسكربتي في الوقت الحقيقي، ويمكن تطبيقها على كل واحدة من الخلايا في المختبر وفي الحيوانات الحيةالنماذج.
تحويل عامل النمو مما يشير إلى بيتا (TGF-β) ينظم العديد من الوظائف الهامة المطلوبة للتوازن الخلوية ويوجد عادة overexpressed في العديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان. TGF-β بشدة تورط في ورم خبيث خلال أواخر مرحلة تطور السرطان، تفعيل مجموعة فرعية خلايا السرطانية الكثيرة الارتحال والغازية. الأساليب الحالية للإشارات تحليل مسار التركيز على نماذج نقطة النهاية، والتي غالباً ما تحاول قياس الإشارات وظيفة مخصصة للحدث البيولوجي ولا تعكس الطابع التدريجي لهذا المرض. هنا، علينا أن نظهر إتش رواية مراسل نظام محدد للمسار TGF-β/Smad3 إرسال الإشارات التي يمكن الكشف عن التنشيط النسخي في الخلايا الحية. استخدام مراسل الإعلانية-كاجا12-Td-توم ، يمكننا أن نحقق معدل إصابة بنسبة 100% من جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا ضمن 24 ساعة في المختبر. يسمح استخدام مراسل الفلورسنت لتصوير خلايا حية في الوقت الحقيقي مع التعرف المباشر من الخلايا النشطة ترانسكريبتيونالي. تنشيط الخلايا المصابة مع TGF-β يعرض مجموعة فرعية فقط من الخلايا التي يتم ترانسكريبتيونالي النشط والمشاركة في الوظائف البيولوجية المحددة. يسمح هذا النهج بخصوصية عالية وحساسية على مستوى خلية واحدة تعزيز فهم الوظائف البيولوجية المتصلة ب TGF-β الإشارات في المختبر. Smad3 يمكن أيضا أن يكون النشاط الترانسكربتي عنها في فيفو في الوقت الحقيقي من خلال التطبيق الإعلانية-كاجا12-لوك المراسل. الإعلانية-كاجا12-لوك يمكن أن يقاس بنفس الطريقة كخطوط الخلايا لوسيفراس ستابلي transfected التقليدية. يمكن تحليلها من خلال تصوير إيفيس التقليدية Smad3 النسخي نشاط الخلايا مزروع في فيفو ورصدها لايف أثناء تطور الورم، تقديم رؤية فريدة من نوعها في ديناميات مسار الإشارات TGF-β. لدينا بروتوكول وصف نظام تسليم مراسل مفيد السماح للتصوير الفائق السريع للخلايا الحية مما يشير إلى مسارات في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. ويمكن توسيع هذا الأسلوب على مجموعة من الصور على أساس فحوصات ويعرض كنهج حساسة واستنساخه للبيولوجيا الأساسية والتنمية العلاجية.
تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) هو سيتوكين أساسي المتورطين في التنمية البشرية أن الإشارات عبر هيتيروديميريك معقدة تتألف من النوع الثاني، والنوع الأول من مستقبلات1. ملزم بكتابة مستقبلات الثاني النتائج في التوظيف والفسفره من نوع أنا مستقبلات، الذي بدوره فوسفوريلاتيس المصب Smad2/3 البروتينات2،3. تنشيط هذه Smad2/3 ربط البروتينات Smad4، تشكيل مجمع translocates إلى النواة، وينظم الجينات النسخ4. تحت شروط التماثل الساكن TGF-β/سمد مما يشير إلى أحكام تنظم؛ ومع ذلك، في العديد من الأمراض، مسار الإشارات هو رفع الضوابط التنظيمية و overexpressed غالباً ما تؤدي إلى تطور المرض5،،من67. أظهرت الدراسات الأخيرة أن الاستجابة الخلوية إلى TGF-β ايربان والفئات السكانية الفرعية TGF-β/سمد الخلايا النشطة المسؤولة عن الوظيفة البيولوجية ب طريقة تعتمد على الوقت8،9. تحليل الخلوية المشتركة مما يشير إلى TGF-β/سمد ينطوي على استخدام نقطة نهاية ثابتة فحوصات أن توفر سوى لقطة نشاط الخلوي وغالباً ما قوانتيتاتي TGF-β/سمد تأثير متوسط10. هذه الأساليب، ومع ذلك، قد لا بدقة تمثل تصرفات الجزيئية TGF-β/سمد إشارات في حالة فسيولوجية أثناء تطور المرض. التقاط الصورة القائمة على تحليل الخلايا الحية ديناميات العمليات الخلوية والبيولوجية مع فهم المكانية والزمانية.
أن هدفنا التوصل إلى أسلوب الفائق حساسية لتصوير الخلايا الحية من TGF-β/سمد مما يشير إلى استخدام الكواشف المستندة إلى إتش. هنا، نحن المصابين خط خلية سرطان الثدي البشرية MDA-ميغابايت-231 إتش التعبير عن تسلسل ربط الحافز كاجا Smad3 ولوسيفراس (لوك) أو الجينات مراسل Td-الطماطم (Td-توم). توفر أنظمة مراسل أدينوفيرال طريقة رخيصة وسريعة لإدخال بلازميد التي يمكن أن يسفر عن معدل إصابة بنسبة 100% في خطوط خلايا السرطان. نظم مراسل أدينوفيرال كما طبقت بنجاح إلى خطوط الخلايا التي يصعب على ترانسفيكت مع بلازميد التقليدية11. في هذا البروتوكول ونحن سوف تصف عملية استنساخه وموسع لتحقيق تصوير الخلايا الحية لمسار TGFβ/سمد الإشارات في الجسم الحي وفي المختبر.
قمنا بتطوير تقنية للسماح للتصوير في الوقت الحقيقي من إشارات TGF-β/Smad3 في الخلايا الحية المفردة. باستخدام هذا الأسلوب الرواية، سابقا حددنا عدد سكان الفرعية للخلايا مع دينامية النشاط النسخي TGF-β/Smad3 الذي ارتبط بغزو المحسنة والهجرة8. يحسن هذا الأسلوب على الاختبارات التقليدية للإشا…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل منح مقدمة من “الوطنية للصحة” ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) لبعض ح. تمبو مستلم “جائزة أستراليا العليا” من “الحكومة الأسترالية” و “أن هندرسون منحة دراسية” أعلى حتى من “الأسترالية الروتاري الصحة” في شريك مع منظمة الروتاري تيمبليستووي وتناول العشاء لعلاج.
DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
Luminometer | Promega | 9100-002 | |
Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
Solution | Composition | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |