Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.
Transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering reguleert vele belangrijke functies die nodig zijn voor cellulaire homeostase en wordt vaak gevonden in veel ziekten, waaronder kanker overexpressie. TGF-β is sterk betrokken bij de metastase tijdens late stadium kanker progressie, het activeren van een subset van migratiestromen en invasieve tumorcellen. Huidige methoden voor signalering traject analyse richten op eindpunt modellen, die vaak proberen te meten van signalering post-hoc van de biologische evenement en komen niet overeen met de progressieve aard van de ziekte. Hier tonen we een nieuwe adenovirus verslaggever systeem specifiek voor de TGF-β/Smad3 signalering traject dat transcriptionele activering in levende cellen kan detecteren. Gebruik makend van een verslaggever van Ad-CAGA12-Td-Tom , kunnen we een 100% besmettingsgraad van MDA-MB-231 cellen binnen 24u in vitro. Het gebruik van een fluorescerende verslaggever zorgt voor de beeldvorming van levende enkele cellen in real time met rechtstreekse identificatie van transcriptionally actieve cellen. Stimulatie van geïnfecteerde cellen met TGF-β wordt alleen een subset van cellen die transcriptionally actief en betrokken in de specifieke biologische functies zijn weergegeven. Deze aanpak zorgt voor hoge specificiteit en de gevoeligheid op het niveau van een eencellige om inzicht in de biologische functies gerelateerde TGF-β signalering in vitro. Smad3, transcriptionele activiteit kan ook worden gerapporteerd in vivo in real-time door de toepassing van een Ad-CAGA12– Luc verslaggever. Ad-CAGA12– Luc kan worden gemeten op dezelfde wijze als traditionele stabiel transfected luciferase cellijnen. Smad3 transcriptionele activiteit van cellen geïmplanteerd in vivo kan worden geanalyseerd door middel van conventionele IVIS imaging en gecontroleerd live tijdens de progressie van de tumor, unieke inzicht bijbrengen in de dynamiek van de signalering TGF-β-pathway. Ons protocol beschrijft een voordelige verslaggever leveringssysteem toestaan voor snelle high-throughput beeldvorming van levende cellen signaling pathways zowel in vitro als in vivo. Deze methode kan worden uitgebreid tot een scala aan beeld gebaseerde testen en presenteert als een gevoelige en reproduceerbare aanpak voor zowel de fundamentele biologie en de therapeutische ontwikkeling.
Transformeren groeifactor β (TGF-β) is een essentiële cytokine betrokken in de menselijke ontwikkeling die signalen via een heterodimeric complex bestaande uit type II en type ik receptoren1. Binding met de type II receptor resultaten bij de werving en fosforylering van type ik receptor, dat op zijn beurt kinaseenzym stroomafwaarts Smad2/3 eiwitten2,3. Deze Smad2/3 eiwitten binden aan Smad4, vormen een complex dat translocates in de kern en regelt gene transcriptie4geactiveerd. Homeostatische voorwaarden TGF-β/Smad is signalering strak geregeld is; echter in vele ziekten, het signalering traject is gedereguleerd en vaak leiden tot progressie van de ziekte5,6,7overexpressie. Recente studies hebben aangetoond dat cellulaire reactie op TGF-β heterogeen is en subpopulaties van TGF-β/Smad actieve cellen verantwoordelijk voor biologische functie in een tijd-afhankelijke manier8,9 zijn. Gemeenschappelijke cellulaire analyse van TGF-β/Smad signalering impliceert het gebruik van vaste eindpunt tests die bieden slechts een momentopname van cellulaire activiteit en de gemiddelde TGF-β/Smad effect10vaak te kwantificeren. Deze methoden, maar kunnen niet nauwkeurig vertegenwoordigen de moleculaire gedrag van TGF-β/Smad signalering in de fysiologische staat tijdens de progressie van de ziekte. Beeld-gebaseerde analyse van levende cellen vangen de dynamiek van cellulaire en biologische processen met beide een ruimtelijke en temporele begrip.
Ons doel was het ontwikkelen van een gevoelige methode hoge gegevensdoorvoer voor levende cellen beeldvorming van TGF-β/Smad signalering gebruikmaken van adenovirus gebaseerde reagentia. Hier, besmet we de menselijke borst kanker cellijn MDA-MB-231 met een uiting van de Smad3 CAGA motief bindende volgorde en een luciferase (Luc) of Td-tomaat (Td-Tom) verslaggever gene adenovirus. Adenovirale verslaggever systemen bieden een snelle en goedkope methode voor het plasmide inleiding is die in een 100% besmettingstarief in kanker cellijnen resulteren kan. Adenovirale verslaggever systemen hebben ook met succes toegepast op cellijnen die moeilijk te transfect met conventionele plasmide11. In dit protocol beschrijven we een reproduceerbare en noninvasive proces om levende cellen beeldvorming van de signalering traject van TGFβ/Smad zowel in vivo en in vitro.
Hebben we een techniek om te voorzien in real-time beeldvorming van TGF-β/Smad3 signalering in één levende cellen. Met deze nieuwe methode hebben we eerder een subpopulatie van cellen geïdentificeerd met dynamische TGF-β/Smad3 transcriptionele activiteit die werd geassocieerd met verbeterde invasie en migratie8. Deze methode verbetert op traditionele testen voor TGF-β signalering, zoals westelijke vlekken van Smad3 fosforylatie en TGF-β gerichte genexpressie, door het vastleggen van de hete…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) aan H-JZ. TMBW is een ontvanger van een Australia postdoctorale Award van de Australische overheid en de Ann Henderson oplaadbeurt beurs van Australische Rotary gezondheid in partner met Rotary van hoorn en Dine voor een kuur.
DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
Luminometer | Promega | 9100-002 | |
Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
Solution | Composition | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |