כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.
שינוי צורה של גורם גדילה איתות β (TGF-β) מסדיר תפקידים חשובים רבים הדרושים עבור הסלולר הומאוסטזיס, נפוץ overexpressed במחלות רבות, כולל סרטן. TGF-β הוא בחריפות בהפרות גרורות במהלך התקדמות סרטן בשלב מאוחר, הפעלת קבוצת משנה של תאים סרטניים נודדות ופולשני. השיטות הקיימות עבור ניתוח מסלול איתות להתמקד על הקצה של דגמים, אשר לעיתים קרובות מנסים למדוד איתות פוסט-הוק של אירוע ביולוגי, ואינם משקפים את אופי המחלה מתקדמת. . הנה, נדגים מסוים מערכת הכתב הרומן אדנו עבור מסלול איתות TGF-β/Smad3 שיכול לזהות הפעלת גנים ברמת השעתוק בתאים חיים. ניצול של הכתב Ad-CAGA12-Td-טום , ניתן להשיג שיעור זיהום 100% של מד א-MB-231 תאים בתוך 24 שעות בתוך חוץ גופית. השימוש של עיתונאי פלורסנט מאפשר הדמיה של תאים בודדים בשידור חי ב בזמן אמת עם זיהוי ישיר של תאים transcriptionally פעיל. גירוי של תאים נגועים עם TGF-β מציג רק תת-ערכה של תאים transcriptionally פעיל ומעורב תפקודים ביולוגיים ספציפיים. גישה זו מאפשרת ירידה לפרטים גבוהה ורגישות ברמה תא בודד כדי לשפר את ההבנה של תפקודים ביולוגיים הקשורים TGF-β איתות במבחנה. Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק ניתן גם דיווח ויוו ב בזמן אמת באמצעות היישום של Ad-CAGA12– לוק כתב. לספירה-CAGA12– לוק ניתן למדוד באופן זהה כקווים תא לוציפראז stably transfected המסורתי. יכול להיות מנותח באמצעות הדמיה IVIS המקובלת ונשאר להשגחה חי במהלך התקדמות הגידול, לספק תובנה ייחודית הדינמיקה של מסלול איתות TGF-β Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק של תאים מושתלים ויוו . פרוטוקול שלנו מתאר מערכת משלוח כתב יתרון המאפשר הדמיה תפוקה גבוהה מהירה של תא חי מסלולי איתות גם במבחנה וגם בתוך vivo. בשיטה זו ניתן להרחיב מגוון של התמונה לפי מבחני במתנה בגישה לשחזור והרגיש יסוד ביולוגיה ופיתוח טיפולית.
שינוי צורה של גורם גדילה β (TGF-β) הוא ציטוקין חיוני מעורבים בהתפתחות האדם כי אותות דרך heterodimeric קומפלקס המורכב מסוג II ו סוג אני קולטנים1. איגוד לסוג קולטן II תוצאות הגיוס, זרחון של סוג אני קולטן, אשר בתורו phosphorylates במורד הזרם Smad2/3 חלבונים2,3. אלה מופעלות Smad2/3 חלבונים לאגד Smad4, יוצרים קומפלקס translocates לתוך הגרעין ומסדיר שעתוק גנים4. בתנאים homeostatic TGF-β/Smad איתות בחוזקה מוסדר; עם זאת, מחלות רבות, מסלול איתות הוא deregulated, לעיתים קרובות overexpressed המוביל התקדמות של המחלה5,6,7. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תגובת תאי TGF-β heterogenous, subpopulations של תאים פעילים TGF-β/Smad אחראים על תפקוד ביולוגי ב8,באופן תלוי-זמן9. ניתוח הסלולר הנפוצות של TGF-β/Smad איתות כרוך השימוש של מבחני קבוע נקודת הקצה לספק רק תמונה של פעילות תאית, לעיתים קרובות quantitate של אפקט ממוצע TGF-β/Smad10. שיטות אלו, עם זאת, לא במדויק ייצגו ההתנהגויות מולקולרית של TGF-β/Smad איתות במצב פיזיולוגי במהלך התקדמות המחלה. תמונה מבוססי ניתוח של תאים חיים ללכוד את הדינמיקה של הסלולר תהליכים ביולוגיים עם הבנה הן יכולות.
המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה תפוקה גבוהה רגיש של תא חי הדמיה של TGF-β/Smad איתות באמצעות ריאגנטים המבוסס על אדנו. כאן, אנחנו נגועים הקו התא סרטן השד אנושי מד א-MB-231 עם אדנו המבטאת את רצף מחייב מוטיב Smad3 CAGA, לוציפראז (לוק) או Td-עגבניות (Td-טום) מדווח. מערכות כתב adenoviral מספקות שיטה מהירה וזולה מבוא פלסמיד שיכול לגרום שיעור זיהום 100% של שורות תאים סרטן. מערכות כתב adenoviral גם הוחלו בהצלחה על שורות תאים שקשה transfect עם פלסמיד קונבנציונאלי11. ב פרוטוקול זה נתאר תהליך לא פולשנית הדירים להשגת תא חי הדמיה של מסלול איתות TGFβ/Smad הן vivo והן בתוך חוץ גופית.
פיתחנו שיטה כדי לאפשר הדמיה בזמן אמת של TGF-β/Smad3 איתות בתאים חיים יחיד. הרומן בשיטה זו בעבר זיהינו אוכלוסיה המשנה של תאים עם דינמי TGF-β/Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק שהיה משויך הפלישה משופר והעברה8. שיטה זו משפרת על מבחני המסורתי של TGF-β איתות, כגון שהכלים המערבי של זרחון Smad3 ו- TGF-β ממ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) H-JZ. TMBW הוא הנמען של פרס לתארים מתקדמים אוסטרליה מן הממשלה האוסטרלית ו אן הנדרסון הטען את המלגה הבריאות רוטרי אוסטרלי בשותף עם סיבובי של Templestowe, דיין לריפוי.
DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
Luminometer | Promega | 9100-002 | |
Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
Solution | Composition | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |