在这里, 我们提出了一个使用腺病毒记者系统的 TGF-β/Smad3 信号活动的活细胞成像协议。该系统实时跟踪转录活性, 可用于体外和活体动物模型中的单细胞.
转化生长因子β (TGF) 信号调节细胞稳态所需的许多重要功能, 在许多疾病, 包括癌症中普遍发现抗原。TGF β在晚期癌症进展中与转移有强烈牵连, 激活了迁移和侵袭性肿瘤细胞的一个子集。目前的信号通路分析方法侧重于端点模型, 通常试图测量生物事件后的信号, 不反映疾病的渐进性质。在这里, 我们展示了一个新的腺病毒记者系统特定的 TGF-β/Smad3 信号通路, 可以检测转录激活的活细胞。利用Ad CAGA12-Td-汤姆记者, 我们可以在24 小时内达到 100% MDA-MB-231 细胞感染率。使用荧光记者可以实时地对活单细胞进行成像, 直接识别转录活性细胞。用 TGF β刺激感染细胞, 只显示转录活性和参与特定生物学功能的细胞子集。这种方法允许在单个细胞水平高特异性和敏感性, 以增强对与 TGF β信号的生物学功能的认识。Smad3 转录活动也可以在体内实时报告通过应用一个Ad CAGA12-卢克记者。CAGA12-卢克可以用与传统稳定转染的荧光素酶细胞系相同的方式来测量。Smad3在体内植入细胞的转录活性可以通过常规的 IVIS 影像分析, 并在肿瘤进展过程中进行监测, 为 TGF β信号通路的动力学提供独特的洞察力。我们的协议描述了一个有利的报告传递系统, 允许快速高通量成像的活细胞信号通路的体外和体内。这种方法可以扩展到一系列基于图像的检测, 并呈现为基础生物学和治疗发展的敏感和可重复的方法。
转化生长因子β (TGF β) 是人类发展中的一项重要的细胞因子, 它通过由 II 型和 I 型受体1组成的 heterodimeric 复合物发出信号。对 II. 型受体的结合导致 I 型受体的招募和磷酸化, 进而 phosphorylates 下游 Smad2/3 蛋白2,3。这些活化 Smad2/3 蛋白绑定到 Smad4, 形成一个复杂的 translocates 进入细胞核和调控基因转录4。在恒定的情况下 TGF β/Smad 信号被严密地调控;然而, 在许多疾病中, 信号通路被解除管制, 并且经常抗原导致疾病的进展5,6,7。最近的研究表明, 细胞对 TGF β的反应是异质的, TGF β/Smad 活性细胞的亚群是以时间依赖性的方式8,9负责生物功能。TGF β/Smad 信号的常见细胞分析涉及使用固定端点化验, 只提供细胞活动的快照, 而且通常定量平均 TGF β/Smad 效应10。然而, 这些方法可能不能准确地反映 TGF-β/Smad 信号在疾病进展过程中生理状态下的分子行为。基于图像的活细胞分析捕捉细胞和生物过程的动态, 既具有空间又有时间的理解。
我们的目标是开发一种灵敏的高通量方法用于活细胞成像的 TGF β/Smad 信号使用腺病毒试剂。在这里, 我们感染了人类乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 与腺病毒表达 Smad3 CAGA 的主题结合序列和荧光素酶 (卢克) 或 td-番茄 (td-汤姆) 报告基因。腺病毒报告系统为质粒的引入提供了一种快速、廉价的方法, 可导致癌细胞株感染率100%。腺病毒报告系统也已成功地应用于细胞系难以染与常规质粒11。在本协议中, 我们将描述一个可重现和无创的过程, 以实现 TGFβ/Smad 信号通路的活体细胞成像在体内和体外。
我们开发了一种技术, 允许实时成像的 TGF-β/Smad3 信号在单个活细胞。利用这一新方法, 我们以前已经确定了一个子群体的细胞与动态 TGF-β/Smad3 转录活动, 与增强入侵和迁移8。该方法改进了传统的 TGF β信号检测, 如 Smad3 磷酸化和 TGF β靶向基因表达的西方印迹, 通过捕获肿瘤人群中 TGF-β/Smad3 信号的异质性, 突出单细胞生物学的重要性。此外, 单细胞成像的替代方法, 如核易位可以?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生和医学研究理事会 (澳洲) 给 H-爵士的赠款的支持。TMBW 是澳大利亚研究生奖的接受者澳大利亚政府和 Ann 亨德森的顶部奖学金从澳大利亚扶轮健康与扶轮 Templestowe 和用餐的治疗。
DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
Luminometer | Promega | 9100-002 | |
Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
Solution | Composition | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |