Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l’efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.
Abstract
Multiforme di glioblastoma (GBM), il cancro primario del cervello più frequenti e più aggressivo negli adulti, è generalmente associato con una prognosi difficile, e sono state proposte terapie efficienti scarse nell’ultimo decennio. Tra i candidati promettenti per la progettazione di nuove strategie terapeutiche, immunoterapie cellulari sono stati designati per eliminare altamente invasive e chemio-radioresistenti cellule del tumore, probabilmente coinvolti in una ricaduta rapida e mortale di questo cancro. Così, somministrazioni di trapianto allogeneic GBM-reattiva effettori delle cellule immuni quali linfociti T Vϒ9Vδ2 umani, in prossimità del tumore sarebbe rappresenta un’opportunità unica per fornire efficiente e altamente concentrato agenti terapeutici direttamente nella sito di tumori maligni del cervello. Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept preclinici per sia la fattibilità e l’efficacia antitumorale di questi cellulari immunoterapie che si basano sulle iniezioni di stereotactic dei linfociti umani allogenici all’interno letti tumore intrabrain.
Introduction
GBM (che grado astrocitoma IV), è il più frequente e aggressivo cancro cerebrali primari negli adulti. Nonostante i trattamenti aggressivi che combinano la chirurgia e la radio-chemioterapia, GBM rimane associato con una prognosi estremamente infausta (sopravvivenza mediana di 14,6 mesi e un 2-anno-mortalità > 73%)1. Questo evidenzia che pochi progressi terapeutici efficienti siano stati convalidati sopra gli ultimi dieci anni2. Tra i candidati per la progettazione delle più efficaci strategie terapeutiche3,4,5, immunoterapie6 sono attualmente esplorati per tenere traccia ed eliminare altamente tumore invasivo e radio/chemio-resistenti cellule, ritenuto sospettate per il loro contributo chiave a tumore rapido e fatale ricaduta7. Vari potenziali bersagli immunologici sono stati individuati e proposti per immunoterapie, che coinvolgano naturale o modificate αβ o linfociti T ϒδ quali antigeni tumorali specifici GBM o indotta da stress molecole8,9, 10. La possibilità di amministrare gli GBM-reattiva effettori delle cellule immuni selezionati rappresenta un’opportunità unica per fornire elevate quantità di linfociti effettori direttamente nel sito di malignità residua. Per supportare questa strategia, abbiamo recentemente dimostrato che modelli basati su topi immunodeficienti xenotrapianti GBM umani primari di orthotopic fedelmente ricapitolano lo sviluppo dei tumori cerebrali in pazienti GBM9,11. Inoltre, questi modelli sono stati utilizzati per dimostrare l’efficacia antitumorale forte dei linfociti Vϒ9Vδ2T passivamente trasferiti umani allogenici.
Questo protocollo descrive la procedura sperimentale critica per raggiungere immunoterapie stereotactic dei tumori cerebrali, come GBM, basato sul trasferimento adottivo di linfociti T allogenici. Illustrato nell’articolo: (i) l’amplificazione dei linfociti terapeutici allogenici T effettori immuni, quali linfociti umani di Vϒ9Vδ2T; (ii) la preparazione di questi linfociti T effettori per iniezione; (iii) la procedura per l’amministrazione stereotactic all’interno del cervello, vicino al tumore. Questo articolo fornisce inoltre la comprensione del comportamento di questi effettori cellulari dopo iniezione stereotactic.
L’approccio terapeutico qui presentata si basa sull’iniezione di 20 x 106 cellule effettrici per dose per ogni mouse immunodeficienti di cervello del tumore-cuscinetto. Un passo di espansione iniziale in vitro è necessaria per produrre grandi quantità di cellule del sistema immunitario. Pertanto, espansioni delle cellule aspecifiche sono effettuati usando la fitoemagglutinina (PHA-L) e irradiato le cellule allogeniche alimentatore: cellule mononucleari sangue periferico (PBMCs) da donatori sani e delle cellule B-linfoblastoidi Epstein Barr Virus EBV-trasformati linee (BLCLs), derivati da PBMCs di infezione in vitro con EBV-contenente cultura surnatante dalla linea cellulare Marmoset B95-8, in presenza di 1 µ g/mL ciclosporina-A.
Le cellule immunitarie effettrici reattive GBM sono rispetto e selezionate da in vitro saggi9. Queste cellule effettrici sono attivate e amplificato mediante protocolli standard, secondo la loro natura (ad es., umano Vγ9Vδ2 T linfociti9 o umano anti-herpes virus αβ T linfociti12) con una purezza minima di > 80%, come ordinariamente controllato dall’analisi cytometric. La procedura di espansione delle cellule riportata di seguito si applica a varie sottopopolazioni di linfociti umani.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un trasferimento adottivo di selezionato nativo o cellule effettrici immuni ingegnerizzati rappresenta un promettente approccio per trattare efficacemente i tumori, quali i tumori al cervello infiltrativo, avendo cura di limitare le reattività contro le cellule non trasformate15, 16,17,18. Tuttavia, il sistema nervoso centrale, che comprende il cervello, ha una particolare condizione immune, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il personale dell’ospedale universitario animale impianto (UTE) di Nantes per zootecnia e cura, il cellulare e tessutale, funzione di memoria dell’Università di Nantes (MicroPICell) di imaging per l’imaging e l’impianto di citometria (Cytocell) da Nantes per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa n #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) e il Consorzio europeo Transcan2 di ERA-Net (Immunoglio). La squadra è finanziata dalla Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Questo lavoro è stato realizzato nel contesto di LabEX IGO e i programmi di IHU-Cesti, supportato con la nazionale Ricerca agenzia Investissements d’Avenir tramite i programmi ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, rispettivamente. Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e della regione Pays de la Loire. Gli autori ringraziano Chirine Rafia per fornire aiuto nella correzione del manoscritto.
Materials
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
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