Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.
Glioblastoma multiforme (GBM), de meest frequente en agressieve primaire hersenenkanker in volwassenen, is over het algemeen geassocieerd met een slechte prognose en schaarse efficiënte therapieën zijn voorgesteld in het afgelopen decennium. Onder de veelbelovende kandidaten voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën, cellulaire immuuntherapie zijn doelwit geweest om te elimineren zeer invasieve en chemo-radioresistant tumorcellen, waarschijnlijk betrokken in een snelle en dodelijke terugval van deze vorm van kanker. Dus, haveninterfaces van allogene GBM-reactieve immuun cel effectoren, zoals menselijke Vϒ9Vδ2 T-lymfocyten, in de nabijheid van de tumor zou Hiermee geeft u een unieke kans om het leveren van efficiënte en hooggeconcentreerde therapeutische agenten rechtstreeks in de site van hersenen maligniteiten. Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een preklinisch bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van deze cellulaire immuuntherapie die afhankelijk zijn van stereotactische injecties van allogene menselijke lymfocyten binnen intrabrain tumor bedden.
GBM (die graad IV astrocytoom), is de meest frequente en agressieve primaire hersenenkanker bij volwassenen. GBM blijft ondanks agressieve behandelingen die een combinatie van chirurgie en radio-chemotherapie, gekoppeld aan een zeer slechte prognose (mediane overleving van 14,6 maanden en een 2-jaar-sterfte > 73%)1. Dit bewijzen dat gedurende de laatste tien jaar2paar efficiënte vooruitgang op therapeutische gebied zijn gevalideerd. Onder de kandidaten voor het ontwerp van meer effectieve therapeutische strategieën3,–4,5, worden immuuntherapie6 momenteel onderzocht om te volgen en te elimineren zeer invasieve en radio/chemo-resistant tumor cellen, verdacht voor hun belangrijke bijdrage aan de snelle en dodelijke tumor herval7. Diverse immunologische doelwit werden geïdentificeerd en voorgestelde voor immuuntherapie, waarbij natuurlijke of gewijzigde αβ of ϒδ T lymfocyten zoals GBM-specifieke tumor-antigenen of stress-geïnduceerde moleculen8,9, 10. De mogelijkheid tot het beheren van geselecteerde GBM-reactieve immuun cel effectoren vertegenwoordigt een unieke gelegenheid om verhoogde hoeveelheid effector lymfocyten leveren rechtstreeks op de site van residuele maligniteit. Ter ondersteuning van deze strategie, hebben wij onlangs aangetoond dat modellen op basis van immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic primaire menselijke GBM xenografts getrouw de ontwikkeling van hersentumoren in GBM-patiënten9,11 recapituleren. Deze modellen werden bovendien gebruikt om aan te tonen van de sterke antitumorale efficiëntie van adoptively overgedragen allogene menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten.
Dit protocol beschrijft de kritische experimentele stappen voor het bereiken van stereotactische immuuntherapie van hersentumoren, zoals GBM, gebaseerd op de adoptieve overdracht van allogene T-lymfocyten. Het artikel toont: (i) de amplificatie van therapeutische allogene immuun effector T lymfocyten, zoals menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten; (ii) de opstelling van deze effector T-lymfocyten voor injectie; (iii) de procedure voor de stereotactische administratie binnen de hersenen, in de buurt van de tumor. Dit artikel bevat ook inzicht in het gedrag van deze cellulaire effectoren na stereotactische injectie.
De hier gepresenteerde therapeutische benadering is gebaseerd op de injectie van 20 x 106 effector cellen per dosis voor elke brain tumor-dragende immunodeficiëntie muis. Een eerste in vitro uitbreiding stap is vereist voor de productie van grote hoeveelheden van immuuncellen. Dus, niet-specifieke cel uitbreidingen zijn uitgevoerd met behulp van phytohemagglutinin (PHA-L) en bestraalde cellen van allogene feeder: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van gezonde donoren en Epstein Barr Virus EBV-getransformeerd B-lymphoblastoid cel lijnen (BLCLs), door in vitro infectie met EBV-bevattende cultuur supernatant van de cellijn Hapalomys B95-8, in aanwezigheid van 1 µg/mL cyclosporin-A. PBMCs afgeleid
GBM-reactieve effector immuuncellen worden vergeleken en geselecteerd uit in vitro testen9. Deze effector cellen worden geactiveerd en gebruikt standaard protocollen, volgens hun aard (bijvoorbeeld, menselijke Vγ9Vδ2 T-lymfocyten9 of menselijke anti-herpes virus αβ T lymfocyten12) met een minimale zuiverheidsgraad van > 80%, als routinematig versterkt gecontroleerd door analyse van de cytometrische. De cel expansie procedure hieronder geldt voor de diverse menselijke lymfocyt deelverzamelingen.
Een adoptief overdracht van geselecteerde native of gemanipuleerde immuun effector cellen vertegenwoordigt een veelbelovende aanpak om efficiënt het behandelen van tumoren, zoals infiltratieve hersenen kanker, het verzorgen van de beperking van de reactivities tegen niet-getransformeerd cellen15, 16,17,18. Het centrale zenuwstelsel, die bestaat uit de hersenen, heeft echter een bijzondere imm…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken het personeel van het universitair ziekenhuis dier faciliteit (UTE) van Nantes voor veeteelt en zorg, de cellulaire en tissular imaging core faciliteit van de Universiteit van Nantes (MicroPICell) voor de beeldvorming en de Cytometry faciliteit (Cytocell) vanuit Nantes voor hun deskundige technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) en het Europese ERA-Net Transcan2-consortium (Immunoglio). Het team wordt gefinancierd door de Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Dit werk werd gerealiseerd in het kader van de LabEX IGO en de IHU-Cesti programma’s, ondersteund door de nationale onderzoek bureau Investissements d’Avenir via de programma’s ANR-11-LABX-0016-01 en ANR-10-IBHU-005, respectievelijk. Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door Nantes Metropole en de regio Pays de la Loire. De auteurs bedanken Chirine Rafia voor het verstrekken van hulp bij het corrigeren van het manuscript.
PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
BLCLs | from 3 different donors | ||
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
FCS | Dutscher | S1810-500 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
IL-2 | Novartis | proleukin | |
PHA-L | Sigma | L4144 | |
Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
Scissors | WPI | 201758 | |
Forceps | WPI | 501215 | |
OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |