立体定向移植人胶质瘤多形性移植小鼠细胞毒性免疫细胞模型的研究
Summary
在这里, 我们提出了一项协议, 以制备和立体定向管理的异基因人淋巴细胞在 immunodeficient 小鼠携带原位人原发性脑肿瘤。本研究为 intrabrain 细胞免疫疗法的可行性和抗肿瘤疗效提供了概念验证。
Abstract
胶质瘤多形性 (肾小球) 是成人中最常见和最有攻击性的原发性脑癌, 通常与预后较差有关, 在过去十年中提出了缺乏有效的治疗方法。在设计新的治疗策略的有希望的候选者中, 细胞免疫疗法已被用来消除高度侵袭性和化疗放射抗拒肿瘤细胞, 可能涉及迅速和致命复发的癌症。因此, 在肿瘤附近的同种异体肾小球-反应性免疫细胞效应剂 (如人 vυ9vδ2 T 淋巴细胞) 的管理, 将是一个独特的机会, 以提供高效和高度集中的治疗药物直接进入脑恶性肿瘤现场。在这里, 我们提出了一项协议, 以制备和立体定向管理的异基因人淋巴细胞在 immunodeficient 小鼠携带原位人原发性脑肿瘤。本研究为这些细胞免疫疗法的可行性和抗肿瘤效果提供了一个临床前的概念证明, 它们依赖于 intrabrain 肿瘤床内的异基因人淋巴细胞的立体定向注射。
Introduction
肾小球 (IV. 型星形细胞瘤) 是成人最常见和最有攻击性的原发性脑癌。尽管有积极的治疗, 结合手术和射频化疗, 肾小球仍然与一个非常糟糕的预后 (中位存活率14.6 月和2年死亡率 > 73%)1。这一证据表明, 在过去十年2中, 没有有效的治疗进展得到证实。在设计更有效的治疗策略3,4,5, 免疫疗法6的候选者中, 目前正在探索追踪和消除高度侵入性和无线电/抗化疗肿瘤细胞, 怀疑他们的关键贡献迅速和致命的肿瘤复发7。对免疫疗法的各种潜在免疫指标进行了鉴定和建议, 涉及天然或改良的αβ或υδ T 淋巴细胞, 如肾小球特异肿瘤抗原或应力诱导分子8,9, 10。管理选定的肾小球活性免疫细胞效应器的可能性代表了一个独特的机会, 提供高数量的效应淋巴细胞直接进入残余恶性肿瘤的部位。为支持这一策略, 我们最近发现, 基于 immunodeficient 小鼠的同种异体肾小球移植的模型忠实地重述了肾小球肿瘤的发展9,11。此外, 这些模型被用来证明过继转输转移异体人 vυ9vδ2t 淋巴细胞的强抗癌功效。
本协议描述了在同种异体 T 淋巴细胞的移植基础上实现脑肿瘤立体定向免疫疗法的关键实验步骤。本文说明: (i) 治疗同种异体免疫效应 T 淋巴细胞 (如人 vυ9vδ2t 淋巴细胞) 的扩增;(ii) 制备注射用的这些效应 T 淋巴细胞;(iii) 大脑内立体定向管理的程序, 靠近肿瘤。本文还介绍了立体定向注射后这些细胞效应的行为。
这里提出的治疗方法是基于每剂量 20 x 106效应细胞为每个脑肿瘤-轴承 immunodeficient 鼠注射。一个初始的体外扩张步骤是需要产生大量的免疫细胞。因此, 非特异细胞扩张是使用 phytohemagglutinin (PHA L) 和辐照异基因饲养细胞: 外周血单个核细胞 (PBMCs) 的健康捐献者和 eb 病毒 (eb) 转换的 B-永生细胞线 (BLCLs), 从 PBMCs 的体外感染, 从狨 B95-8 细胞系的 eb 病毒的培养上清液中提取, 在1µg/毫升环孢素 a 的存在。
从体外测定9中比较和选择了肾小球活性效应免疫细胞。这些效应细胞的激活和放大使用标准协议, 根据其性质 (例如, 人类 Vγ9Vδ2 T 淋巴细胞9或人抗疱疹病毒αβ T 淋巴细胞12) 与最低纯度 > 80%, 例行由细胞分析检查。下面详述的细胞扩张程序适用于各种人类淋巴细胞子集。
Protocol
Representative Results
Discussion
经选择的本机或工程免疫效应细胞的移植, 是有效治疗肿瘤的一种有希望的方法, 如浸润性脑癌, 注意限制活性对非转化细胞15, 16,17,18。然而, 包括大脑在内的中枢神经系统具有特殊的免疫状态, 特别是由于血脑屏障的存在以及缺乏典型的淋巴引流系统19、20。…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢南特大学医院动物设施 (犹特人) 的工作人员畜牧和护理, 南特大学的细胞和 tissular 成像核心设施 (MicroPICell) 的成像, 和从南特的细胞术设施 (Cytocell)他们的专家技术援助。这项工作由 INSERM、CNRS、大学 de 南特、国立杜肿瘤研究所 (INCa#PLBio2014-155)、国家民族反癌症 (AO 区域间 2017) 和欧洲联盟时代网 Transcan2 (Immunoglio) 资助。这支队伍由研究所 Medicale (DEQ20170839118) 资助。这项工作是在 LabEX 监察员办公室和 IHU Cesti 方案的范围内实现的, 该项目分别由艾文莉和 ANR-11-LABX-0016-01 的国家研究机构 Investissements d ‘ ANR-10-IBHU-005 支助。IHU-Cesti 项目也支持南特都市和支付 la 卢瓦尔地区。作者感谢 Chirine Rafia 为改正手稿提供帮助。
Materials
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
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