Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.
Abstract
Glioblastoma Multiforme (GBM), der häufigsten und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen, ist in der Regel verbunden mit einer schlechten Prognose und knappen effiziente Therapien wurden in den letzten zehn Jahren vorgeschlagen. Unter den vielversprechenden Kandidaten für neue therapeutische Strategien zu entwerfen zelluläre Immuntherapien haben sehr invasive Beseitigung gezielt und Chemo-radioresistenten Tumorzellen, wahrscheinlich in eine schnelle und tödliche Rückfall dieses Krebses beteiligt. So Zwecke der allogenen GBM-reaktive Immunzelle Effektoren, wie menschliche Vϒ9Vδ2 T-Lymphozyten, in der Nähe des Tumors würde stellt eine einzigartige Gelegenheit, effizient zu liefern und hochkonzentrierten therapeutischer Wirkstoffe direkt in die Website des Gehirns Malignome. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine präklinischen Proof-of-Concept für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von diesen zellulären Immuntherapien, die Stereotaktische Injektion von allogenen menschlichen Lymphozyten innerhalb Intrabrain Tumor Betten abhängen.
Introduction
Glioblastom (WHO Grad IV Astrozytom), ist die häufigste und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen. Trotz der aggressiven Behandlungen, die Operation und Radio-Chemotherapie zu kombinieren, bleibt GBM eine extrem schlechte Prognose (mediane Überlebenszeit von 14,6 Monate und eine 2-Jahres-Mortalität > 73 %)1zugeordnet. Dies beweist, dass einige effiziente therapeutische Fortschritte in den letzten zehn Jahren2validiert worden sind. Unter den Kandidaten für die Gestaltung effektiver Therapiestrategien3,4,5werden Immuntherapien6 derzeit untersucht, um zu verfolgen und zu beseitigen sehr invasiv und Radio/Chemotherapie-resistenten tumor Zellen, für ihren wichtigen Beitrag zur schnellen und tödlichen Tumor Rezidiv7vermutet. Verschiedene mögliche immunologische Ziele wurden identifiziert und vorgeschlagenen für Immuntherapien, mit natürlichen oder modifizierten αβ oder ϒδ T-Lymphozyten wie GBM-spezifischen Tumorantigenen oder Stress-induzierte Moleküle8,9, 10. Die Möglichkeit, ausgewählte GBM-reaktive Immunzelle Effektoren verwalten stellt eine einzigartige Gelegenheit, erhöhte Mengen von Effektor Lymphozyten direkt in die Website der verbleibenden Bösartigkeit zu liefern. Um diese Strategie zu unterstützen, haben wir vor kurzem gezeigt, dass Modelle basierend auf immungeschwächte Mäuse orthotopen primären menschlichen GBM Xenotransplantate treu tragen die Entwicklung von Hirntumoren in GBM Patienten9,11rekapitulieren. Darüber hinaus wurden diese Modelle verwendet, um die starke Antitumor-Effizienz der adoptively übertragenen allogene menschlichen Vϒ9Vδ2T Lymphozyten zeigen.
Dieses Protokoll beschreibt die kritische experimentellen Schritte zur Erreichung Stereotaktische Immuntherapien von Hirntumoren, wie GBM, basierend auf die Adoptiveltern Übertragung der allogenen T-Lymphozyten. Der Artikel zeigt: (i) die Verstärkung der therapeutischen allogene immun Effektor T-Lymphozyten, wie menschliche Vϒ9Vδ2T Lymphozyten; (Ii) die Vorbereitung dieser Effektor T-Lymphozyten zur Injektion; (Iii) das Verfahren für die Stereotaktische Verwaltung innerhalb des Gehirns, in der Nähe des Tumors. Dieser Artikel enthält auch einen Einblick in das Verhalten von diese zellulären Effektoren nach Stereotaktische Injektion.
Der hier vorgestellte Therapieansatz basiert auf die Injektion von 20 x 106 Effektor Zellen pro Dosis für jedes Gehirn Tumor-tragenden immungeschwächte Maus. Ein erste in-vitro- Erweiterung Schritt ist erforderlich, große Mengen von Immunzellen produzieren. Daher unspezifische Zelle Erweiterungen werden mit Phytohemagglutinin (PHA-L) durchgeführt und allogene Feeder-Zellen bestrahlt: Blut-peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) von gesunden Spendern und Epstein-Barr-Virus EBV-transformierten B-Lymphoblastoid Zelle Linien (BLCLs), abgeleitet von PBMCs durch in-vitro- Infektion mit EBV-haltigen Kultur überstand von der Marmoset B95-8-Zell-Linie, im Beisein von 1 µg/mL Cyclosporin-A.
GBM-reaktive Effektor Immunzellen verglichen und von in-vitro- Assays9ausgewählt. Diese Effektorzellen werden aktiviert und verstärkt mit standard-Protokolle, nach ihrer Natur (z.B., menschliche Vγ9Vδ2 T-Lymphozyten-9 oder menschliche Anti-Herpes-Virus αβ T-Lymphozyten12) mit einer Mindestreinheit von > 80 %, wie routinemäßig von durchflusszytometrischen Analyse überprüft. Die Zelle Erweiterung Verfahren unten gilt für verschiedene menschliche Lymphozyten-Teilmengen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine adoptive Übertragung von ausgewählten einheimischen oder veränderter immun Effektorzellen stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von Tumoren, wie z. B. infiltrative Gehirntumoren, kümmert sich der Begrenzung der Reaktivität gegen nicht-transformierten Zellen15effizient, 16,17,18. Das zentrale Nervensystem, das Gehirn umfasst, hat jedoch eine besondere Immunstatus, insb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken die Mitarbeitern der der Universitätsklinik Tierhaus (UTE) von Nantes für Tierhaltung und Pflege, die zelluläre und tissular imaging-zentrale Einrichtung der Universität Nantes (MicroPICell) für die Bildgebung und Zytometrie Anlage (Cytocell) von Nantes für ihre kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INSERM, CNRS Université de Nantes, Institut National du Cancer (Inka #PLBio2014-155), Ligue Nationale Contre le Cancer (AO interregionale 2017) und das Europäische Konsortium ERA-Net Transcan2 finanziert (Immunoglio). Das Team wird von der Fondation Pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118) finanziert. Diese Arbeit wurde im Rahmen des LabEX IGO realisiert und die IHU-Cesti-Programme, unterstützt von der nationalen Forschung Agentur Investissements Avenir über die Programme ANR-11-LABX-0016-01 und ANR-10-IBHU-005, bzw.. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Metropole und der Region Pays De La Loire unterstützt. Die Autoren danken für seine Hilfe bei der Korrektur des Manuskripts Chirine Rafia.
Materials
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
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