Summary

Etiqueta-libre neutrófilo enriquecimiento de la secreción de la vía aérea paciente derivado mediante microfluídica inercial de lazo cerrado

Published: June 07, 2018
doi:

Summary

En esta investigación, se demuestra un método de separación libre de etiqueta neutrófilo de clínica las secreciones mediante la operación de circuito cerrado de la microfluídica inercial espiral. El método propuesto expandiría los ensayos clínicos en vitro para diversas enfermedades respiratorias.

Abstract

Las secreciones contienen una gran cantidad de células de inmune, por ejemplo, neutrófilos, macrófagos y linfocitos, que se pueden utilizar como un recurso importante para evaluar una variedad de enfermedades pulmonares, tanto para fines de investigación y clínicos. Sin embargo, debido a la naturaleza heterogénea y viscosa de moco paciente, hay actualmente ningún método confiable de disociación que no daña las células inmunes del anfitrión en la secreción de la vía aérea paciente. En esta investigación, presentamos un método de preparación de muestra que utiliza la inercia microfluídica para evaluación inmunológica del paciente. Independientemente de las propiedades fluídicas heterogéneas de las muestras clínicas, el método propuesto recupera más del 95% de los neutrófilos de las muestras de secreción de las vías respiratorias que se diluyen 1,000-fold ml de solución salina limpia. Por el flujo de salida concentrado para el depósito de la muestra inicial de recirculación, se proporcionan una alta concentración, recuperación y pureza de las células inmunes; recirculación se considera una relación inversa a la solo jeringa basado funcionamiento de la microfluídica inercial. La operación de circuito cerrado de la microfluídica espiral proporciona leucocitos sin perturbación física o química, como lo demuestra el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)-inducida por la liberación de elastasa de neutrófilos ordenados.

Introduction

Puesto que las células están encapsuladas en una gran cantidad de moco en las secreciones de la vía aérea, la evaluación funcional de los leucocitos por un análisis en vitro ha sido obstaculizada. Ditiotreitol (DTT) es el más común buffer de lisis a disociar y homogeneizar el esputo para análisis citológico y la detección de mediadores al tiempo que proporciona viabilidad tolerable de células aisladas1,2. Sin embargo, TDT puede interferir con antígenos enlazados a la superficie de los neutrófilos en las vías respiratorias, dando por resultado la interrupción de la función del neutrófilo como elastasa y mieloperoxidasa (MPO) liberan2,3. Por lo tanto, se han realizado pocos estudios de la función del neutrófilo humano vía aérea con los neutrófilos de sangre periférica, que no pueden revelar las características fisiológicas de pulmonar4. Mientras tanto, microfluídica inercia ha hecho avances en el aislamiento de las células de varios pacientes biomatrices5,6. El equilibrio entre las fuerzas inerciales elevación y arrastre de Dean alinea la partículas de la célula según su tamaño, que permite la separación de partículas sin etiqueta7. Nuestro grupo ya presentó un método de preparación de muestra para hacer circular el tumor las células8,9, patógenos en sangre8, las células de una suspensión cultura10,11, 12y leucocitos polimorfonucleares (PMNs) de sangre13,14.

Aquí, presentamos un protocolo para preparar las células inmunes de las secreciones de las vías respiratorias de un paciente mediante microfluídica inercial de lazo cerrado para un análisis de aguas abajo en vitro , tales como el ensayo de elastasa (NE). Este método proporciona alta concentración y recuperación, especialmente cuando hay una superposición significativa en el sentido lateral de la célula/partícula de que la célula/partículas de interés debe eliminarse, que es comúnmente observado en muestras clínicas. Por la pared interna (IW) de recirculación-enfocadas grandes partículas o células hacia el tubo de muestra de entrada, la partícula o célula de interés concentrados en el depósito original, mientras que fluidos de fondo con agregados de mucina pequeños pasan por el depósito de residuos. A pesar de las heterogéneas propiedades fluídicas de muestras clínicas, el método propuesto se recupera constantemente sobre el 95% de los neutrófilos de las muestras de secreción de las vías respiratorias que se diluyen 1,000-fold con una solución salina limpia (~ 1 mL). Por el contrario, el método de lisis presenta una amplia gama de PMNs tasas de recuperación dependiendo de la condición de la muestra. El protocolo propuesto captura leucocitos de manera libre de etiqueta sin interrupciones físicas o químicas, que ofrece la posibilidad de cosechar células delicadas de desafío clínico biometría con procedimientos mínimamente invasivos.

Protocol

La colección de la muestra fue aprobada por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Todos los experimentos se realizan bajo una seguridad de la biotecnología con el equipo de protección personal adecuado. 1. dispositivo fabricación y litografía blanda Nota: Las técnicas de litografía blanda estándar15,16 se usaron para crear el microchannel …

Representative Results

Hemos conseguido transparentes suspensiones de células inmune tanto TDT mucolysis y microfluídica la disociación (Figura 3A). Disociación de microfluídica recogidos en promedio 4.40 x 105 PMNs (2.1 x 104 a 5.60 x 105 PMNs, n = 6) de las vías respiratorias secreción muestras diluidas 1,000-fold (volumen total de 50 mL) en 1 mL de suspensión limpio. En comparación con el inicial Diluyente, 94.0% PMNs (CD66b+/…

Discussion

En microfluídica inercial, partículas y células de localización en una determinada posición lateral en un canal de micro basado en su tamaño5,18,19,20. Debido al efecto combinado del Decano arrastre fuerza y la fuerza inercial elevación curvada microchannel, partículas grandes o de neutrófilos (> 10 μm) se encuentran dentro del canal y pequeñas partículas, agregados de moco y residu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por NIH/NIAID (R21AI119042) así como el programa de ensayo NIH U24 muestra escasamente (U24-AI118656).

Materials

PDMS precursor Dow corning 184 SIL ELAST KIT 3.9KG 10:1 ratio of base and curing agent
VWR gravity convection oven VWR 414005-128 PDMS precursor to be cured in 90 deg.
100mm petri dish VWR 89000-324 Fabrication of PDMS Supporting layer
Harris Uni-core puncher Sigma-aldrich WHAWB100076 2mm diameter or other depending on the tubing size
Air plasma machine Femto Science Cute Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.
2” x 3” glass slide TED PELLA, INC. 2195 To support PDMS device
Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 Cole-Parmer EW-96410-14 Tubing for microfluidics and peristlatic pump
1/16 inch Luer connector, male Harvard apparatus PC2 72-1443 Connector for fluid guide
50mL Falcon tube Corning 21008-940 sample collection & preparation
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium Corning 45000-446  Buffer solution to dilute sample
Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm HALYARD HEALTH 22113 Tracheal seceation suction catheter
0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe BD PosiFlush NHRIC: 8290-306547 For tracheal seceation collection from the patients
SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL Simport 1176R36 Sterile sputum (airway secretion) collection container
Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL BD BD309604 To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
BD  Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok  Tip BD To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
40µm nylon cell strainer  Falcon 21008-949 To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.
Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) Cole-Parmer HV-07522-30 operation of microfluidics
BD LSR II flow cytometer BD Bioscience LSR II flow cytometer Quantification of cell recovery ratio
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody BD Bioscience 561927 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody BD Bioscience 561864 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Plate reader Thermo Fisher scientific Varioskan Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525
Neutrophil elastase assay kit Cayman Chemical 600610 Neutrophil functionality assessment
Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm PolyScience, Inc. 18140-2 Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics

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Ryu, H., Choi, K., Qu, Y., Kwon, T., Lee, J. S., Han, J. Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics. J. Vis. Exp. (136), e57673, doi:10.3791/57673 (2018).

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