Summary

Этикетка бесплатно нейтрофилов обогащения от секрецию дыхательные пути пациента, полученных с помощью замкнутых инерционного микрофлюидика

Published: June 07, 2018
doi:

Summary

В этом исследовании мы демонстрируем метода метку бесплатно нейтрофилов разделения от клинических дыхательных путей выделениями, используя замкнутого цикла эксплуатации спираль инерционного микрофлюидика. Предложенный метод расширит клинических в vitro анализов для различных респираторных заболеваний.

Abstract

Дыхательных путей выделениями содержат большое количество связанных с иммунной клетки, например, нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты, которые могут быть использованы в качестве основных ресурсов для оценки различных легочных заболеваний, как для научных исследований и клинических целей. Однако из-за разнородных и вязких характер пациента слизи, в настоящее время нет надежных диссоциации метод, который не повредить принимающей иммунные клетки в дыхательные пути пациента секрецию. В этом исследовании мы представляем пример подготовка метод, который использует инерционного микрофлюидика иммунной оценки пациента. Независимо от свойства гетерогенных аэрогидродинамических клинических образцов, предложенный метод восстанавливает более чем 95% нейтрофилов из дыхательных путей секрецию образцы, которые разбавляют Гарибова миллилитрами чистой соленой. По рециркуляции концентрированной выходной поток для первоначальной выборки водохранилище, предоставляются высокой концентрации, восстановления и чистоту иммунных клеток; рециркуляция считается компромисс для работы на основе шприц сингл запуск инерционного микрофлюидика. Замкнутого цикла эксплуатации спираль микрофлюидика обеспечивает лейкоциты без физического или химического вмешательства, как продемонстрировано phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA)-индуцированной эластазы релиз отсортированных нейтрофилов.

Introduction

Поскольку клетки инкапсулированы в большое количество слизи в дыхательных путей выделениями, функциональной оценки лейкоцитов в assay в vitro был затруднен. Дитиотреитол (DTT) является наиболее распространенным буфера lysis отмежеваться и гомогенизации мокроты для цитологического анализа и выявления посредников обеспечивая допустимых жизнеспособность изолированных клеток в1,2. Однако DTT может помешать с привязкой к поверхности антигены сократимость нейтрофилов, что приводит к нарушению нейтрофилов функции такие как эластазы и миелопероксидаза (МПО) релиз2,3. Таким образом было проведено несколько исследований человеческого сократимость нейтрофилов функции с нейтрофилов периферической крови, которые могут не выявить физиологические характеристики легочной4. Тем временем инерционного микрофлюидика добилась успехов в изоляции клетки от различных пациентов biomatrices5,6. Равновесие между инерционного подъем сил и перетащите Дин выравнивает частиц/ячейку согласно их размер, который позволяет лейбл свободной частицы разделения7. Наша группа ранее представил метод подготовки образца для распространения опухоли клетки8,9, патогенов в крови8, клетки от подвеска культуры10,11, 12и полиморфноядерных лейкоцитов (ПНЛ) от крови13,14.

Здесь мы представляем протокол подготовить иммунные клетки от пациента выделениями дыхательных путей с помощью замкнутых инерционного микрофлюидика для вниз по течению в vitro assay, таких как assay нейтрофилов эластазы (NE). Этот метод обеспечивает высокую концентрацию и восстановления, особенно когда есть значительное перекрытие в боковой направлении клеток/частиц из которого клеток/частиц из интерес является быть удалены, который обычно наблюдается в клинических пробах. По рециркуляции Внутренняя стена (IW)-сосредоточены крупные частицы или ячейки ввода образца трубки, частицы или ячейки интерес концентратов в оригинальной водохранилище, в то время как фон жидкости с небольшой муцина агрегаты проходят через отходов водохранилище. Несмотря на свойства гетерогенных аэрогидродинамических клинических образцов, предложенный метод восстанавливает последовательно выше 95% нейтрофилов из дыхательных путей секрецию образцы, которые разбавляют Гарибова с чистой физиологическим раствором (~ 1 мл). Напротив метод лизис представляет широкий ассортимент ПНЛ ставок возмещения в зависимости от состояния образца. Предлагаемый протокол захватывает лейкоциты образом ярлык бесплатно без физического или химического перерывов, который обеспечивает возможность собрать тонкие клетки от клинически сложных Биометрия с минимально инвазивных процедур.

Protocol

Пример коллекции была утверждена университета Питтсбурга институциональных Наблюдательный Совет (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Все эксперименты по биобезопасности, кабинет с надлежащего личного защитного оборудования. 1. устройство изготовление и мягкие литография <p class="jove_content"…

Representative Results

Мы достигли прозрачный иммунной клеточных суспензий с обеих DTT mucolysis и микрофлюидика диссоциации (рис. 3A). Микрофлюидика диссоциации собранные 4,40 x 105 ПНЛ в среднем (2,1 x 104 5,60 x 105 ПНЛ, n = 6) от сократимость секрецию образцов разбавленный Гар…

Discussion

В инерциальной микрофлюидика частиц и клетки локализовать в определённой боковой позиции в микро канал, основанный на их размер5,18,19,20. Из-за совокупный эффект декан перетащите силы и инерционных подъемная сила в изо?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH/NIAID (R21AI119042) а также NIH U24 образца щадящие пробирного программы (U24-AI118656).

Materials

PDMS precursor Dow corning 184 SIL ELAST KIT 3.9KG 10:1 ratio of base and curing agent
VWR gravity convection oven VWR 414005-128 PDMS precursor to be cured in 90 deg.
100mm petri dish VWR 89000-324 Fabrication of PDMS Supporting layer
Harris Uni-core puncher Sigma-aldrich WHAWB100076 2mm diameter or other depending on the tubing size
Air plasma machine Femto Science Cute Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.
2” x 3” glass slide TED PELLA, INC. 2195 To support PDMS device
Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 Cole-Parmer EW-96410-14 Tubing for microfluidics and peristlatic pump
1/16 inch Luer connector, male Harvard apparatus PC2 72-1443 Connector for fluid guide
50mL Falcon tube Corning 21008-940 sample collection & preparation
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium Corning 45000-446  Buffer solution to dilute sample
Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm HALYARD HEALTH 22113 Tracheal seceation suction catheter
0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe BD PosiFlush NHRIC: 8290-306547 For tracheal seceation collection from the patients
SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL Simport 1176R36 Sterile sputum (airway secretion) collection container
Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL BD BD309604 To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
BD  Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok  Tip BD To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
40µm nylon cell strainer  Falcon 21008-949 To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.
Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) Cole-Parmer HV-07522-30 operation of microfluidics
BD LSR II flow cytometer BD Bioscience LSR II flow cytometer Quantification of cell recovery ratio
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody BD Bioscience 561927 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody BD Bioscience 561864 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Plate reader Thermo Fisher scientific Varioskan Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525
Neutrophil elastase assay kit Cayman Chemical 600610 Neutrophil functionality assessment
Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm PolyScience, Inc. 18140-2 Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics

References

  1. Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
  2. van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
  3. Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
  4. Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
  5. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
  6. Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
  7. Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
  8. Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
  9. Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
  10. Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
  11. Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
  12. Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
  13. Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
  14. Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
  15. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
  16. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  17. Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
  18. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
  19. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
  20. Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
  21. Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
  22. Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
  23. Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
  24. Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
  25. Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
  26. Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).

Play Video

Cite This Article
Ryu, H., Choi, K., Qu, Y., Kwon, T., Lee, J. S., Han, J. Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics. J. Vis. Exp. (136), e57673, doi:10.3791/57673 (2018).

View Video