העשרה ללא תווית נויטרופילים של הפרשת נגזר המטופל דרכי הנשימה באמצעות לולאה סגורה אינרציאלית מיקרופלואידיקה
Summary
במחקר זה, נדגים שיטה ללא תווית נויטרופילים ההפרדה מן הפרשות דרכי הנשימה קליניים באמצעות לולאה סגורה הפעולה של ספירלה מיקרופלואידיקה אינרציאלית. השיטה המוצעת ירחיב את מבחני קליניים במבחנה למחלות בדרכי הנשימה שונים.
Abstract
הפרשות דרכי הנשימה מכילים מספר רב של תאים הקשורים החיסון, למשל, נויטרופילים, מאקרופאגים לימפוציטים, אשר יכול לשמש כמשאב מרכזי כדי להעריך את מגוון של מחלות, הן במחקר והן למטרות קליניות. עם זאת, בשל אופיו הטרוגנית, צמיגה של ריר החולה, אין כרגע אין שיטה דיסוציאציה אמין זה אינו גורם נזק תאים חיסוניים מארח בהפרשה החולה את דרכי הנשימה. במחקר זה, אנו מציגים את שיטת הכנה לדוגמה המשתמשת מיקרופלואידיקה אינרציאלית להערכת המערכת החיסונית של החולה. בין המאפיינים fluidic הטרוגנית של הדגימות קליני, השיטה המוצעת משחזרת יותר מ 95% של נויטרופילים מ והמדגמים הפרשת דרכי הנשימה הם מדולל 1,000-fold עם מיליליטר של תמיסת מלח נקיים. על ידי צואה הנחל פלט מרוכז למאגר דגימה ראשונית, ריכוז גבוה, שחזור, הטוהר של תאים חיסוניים הינם מסופקים; recirculation נחשב פשרה בניהול משפחתי יחיד המבוססת על המזרק פעולת מיקרופלואידיקה אינרציאלית. הפעולה לולאה סגורה של ספירלה מיקרופלואידיקה מספק לויקוציטים ללא הפרעה פיזית או כימית, כפי שמגלה את phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA)-induced elastase שחרורו של נויטרופילים ממוינים.
Introduction
מאז תאים כמוסות ב כמות גדולה של ריר ב הפרשות דרכי הנשימה, יש כבר הפריע את ההערכה תפקודית של לויקוציטים מאת assay במבחנה . Dithiothreitol (DTT) הוא המאגר פירוק הנפוץ ביותר ועד מביצועם homogenize ברוק עבור ניתוח cytological וזיהוי של המגשרים תוך מתן נסבל הכדאיות של תאים בודדים1,2. עם זאת, DTT יכול להתערב עם משטח מכורך אנטיגנים של דרכי הנשימה נויטרופילים, והתוצאה היא שיבוש תפקוד נויטרופילים כגון elastase myeloperoxidase (MPO) עדכוני2,3. לכן, נערכו מחקרים מעטים של דרכי הנשימה האנושית תפקוד נויטרופילים עם דם היקפיים נויטרופילים, אשר עשויים לגלות מאפיינים פיזיולוגיים של ריאתי4. בינתיים, מיקרופלואידיקה אינרציאלית עשה התקדמות לבודד תאים שונים biomatrices החולה5,6. האיזון בין כוחות מעלית אינרציאלית וגרור דין יישור החלקיק/התא על פי גודלם, אשר מאפשר הפרדה חלקיק ללא תווית7. הקבוצה שלנו הציג בעבר שיטת הכנה מדגם מחזורי גידול תאים8,9, פתוגנים בדם8, תאים הבולם תרבות10,11, 12, ואת אורך חייהם לויקוציטים (PMNs) של דם13,14.
כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול להכין את התאים החיסוניים מ הפרשות דרכי הנשימה של המטופל באמצעות לולאה סגורה מיקרופלואידיקה אינרציאלית במורד הזרם במבחנה assay, כגון וזמינותו elastase נויטרופילים (NE). שיטה זו מספקת גם ריכוז גבוה וגם התאוששות, במיוחד כשמדובר חפיפה משמעותי בכיוון לרוחב של התא/החלקיק שממנו התא/החלקיקים-של-הריבית הוא יוסר, אשר בדרך כלל נצפית בדגימות קליניות. על ידי צואה החומה הפנימית (IW)-ממוקד חלקיקים גדולים או תאים בחזרה אל הצינור מדגם קלט, חלקיק או תא-של-עניין תרכיזים במאגר המקורי, בעוד הרקע נוזלים עם אגרגטים mucin קטנים עוברים דרך המאגר פסולת. למרות המאפיינים fluidic הטרוגנית של דגימות קליניות, השיטה המוצעת משחזרת בעקביות מעל 95% של נויטרופילים מדגימות הפרשת דרכי הנשימה זה הם מדולל 1,000-fold עם פתרון נקי מלוחים (~ 1 מ”ל). לעומת זאת, שיטת פירוק מציג מגוון רחב של PMNs השחזור המחירים בהתאם לבעיה מדגם. הפרוטוקול המוצע לוכדת לויקוציטים באופן ללא תווית עם אין הפרעה פיזית או כימית, אשר מספק את האפשרות לקצור תאים עדין קלינית מאתגר ביומטריה עם נהלים פולשנית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב מיקרופלואידיקה אינרציאלית, חלקיק ותאים לשפה במיקום לרוחב מסוים במיקרו-ערוץ מבוסס על שלהם גודל5,18,19,20. בשל ההשפעה המשולבת של הדיקן גררו כוח וכוח הרמה אינרציאלית microchannel מעוקל, חלקיקים גדולים או נויטרופילים (> 10 מיקרומטר)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIAID (R21AI119042) כמו גם תכנית NIH ממעט מדגם U24 assay (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
