Summary

تخصيب خالية من تسمية العَدلات من إفراز مجرى الهواء المستمدة من المريض استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي

Published: June 07, 2018
doi:

Summary

في هذا البحث، نبدي طريقة فصل خالية من تسمية العَدلات من إفرازات السريرية مجرى الهواء باستخدام عملية مغلقة من دوامة القصور الذاتي ميكروفلويديكس. الطريقة المقترحة ستوسع فحوصات سريرية في المختبر لأمراض الجهاز التنفسي المختلفة.

Abstract

مجرى الهواء إفرازات تحتوي على عدد كبير من الخلايا المتصلة بجهاز المناعة، مثلاً، العَدلات، الضامة، والخلايا الليمفاوية، التي يمكن استخدامها كمورد رئيسي لتقييم مجموعة متنوعة من الأمراض الرئوية، سواء بالنسبة للبحوث والأغراض السريرية. ومع ذلك، نظراً للطبيعة غير المتجانسة ولزوجة المخاط المريض، يوجد حاليا أي أسلوب الانفصال الموثوق بها التي لا تضر بالخلايا المناعية المضيف في إفراز مجرى الهواء المريض. في هذا البحث، علينا الأخذ بأسلوب إعداد نموذج يستخدم ميكروفلويديكس القصور الذاتي للتقييم المناعي للمريض. بغض النظر عن خصائص العينات السريرية فلويديك غير المتجانسة، يستعيد الطريقة المقترحة أكثر من 95 في المائة العَدلات من عينات إفراز مجرى الهواء التي هي المخفف 1,000-fold مع ملليلتر من المحلول الملحي نظيفة. وترد بتعميم دفق الإخراج المركزة إلى خزان عينة أولية، تركيزات عالية والانتعاش والنقاء من الخلايا المناعية؛ ويعتبر إعادة تدوير مفاضلة لتشغيل المستندة إلى حقنه واحدة تديرها ميكروفلويديكس القصور الذاتي. وتقدم العملية حلقة مغلقة من دوامة ميكروفلويديكس الكريات البيضاء دون اضطراب الفيزيائية أو الكيميائية، كما يتبين من phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)-الناجم عن إطلاق سراح elastase العَدلات تم فرزها.

Introduction

حيث يتم تغليف الخلايا في كمية كبيرة من المخاط في مجرى الهواء إفرازات، وعرقل الوظيفية تقييم الكريات البيضاء بفحص في المختبر . ديثيوثريتول (DTT) هو الأكثر شيوعاً تحلل المخزن المؤقت أيوناتها وتجانسه البلغم لتحليل الخلوية والكشف عن الوسطاء مع توفير السلامة مقبولة للخلايا المعزولة1،2. ومع ذلك، القيمة يمكن أن تتداخل مع المستضدات السطحية زمنياً من العَدلات مجرى الهواء، أدى إلى تعطيل وظيفة العَدلات مثل الستسي وميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) الإصدار2،3. ولذلك، أجريت دراسات قليلة من وظيفة العَدلات مجرى الهواء البشرية مع العَدلات الدم المحيطية، التي قد لا تكشف عن الخصائص الفسيولوجية ل الرئة4. وفي الوقت نفسه، ميكروفلويديكس القصور الذاتي قد أحرزت تقدما في عزل الخلايا من مختلف بيوماتريسيس المريض5،6. التوازن بين القوى رفع القصور الذاتي واسحب عميد يحاذي الجسيمات/الخلية وفقا لحجمها، مما يسمح للجسيمات خالية من تسمية الفصل7. عرض مجموعتنا سابقا طريقة إعداد نموذج لتعميم ورم الخلايا8،9، العوامل الممرضة في الدم8خلايا من تعليق ثقافة10،11، 12، والكريات البيض النوى (بمنس) من الدم13،14.

نقدم لك هنا، وضع بروتوكول لإعداد الخلايا المناعية من إفرازات مجرى الهواء للمريض استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي للمتلقين للمعلومات في المختبر مقايسة، مثل المقايسة elastase العَدلات (شمال شرق). يوفر هذا الأسلوب التركيز العالي والانتعاش، ولا سيما عندما يكون هناك تداخل كبير في الاتجاه الأفقي الخلية/الجسيمات منه الخلية/الجسيمات من الفائدة المراد إزالتها، الذي يتم الاحتفال به عادة في العينات السريرية. بتعميم الجدار الداخلية (IW)-تركز الجزيئات الكبيرة أو الخلايا إلى أنبوب العينة الإدخال، والجسيمات أو مركزات الخلية من الفائدة في الخزان الأصلي، بينما يمر السوائل الخلفية مع المجاميع الصغيرة الميوسين خزان النفايات. على الرغم من خصائص العينات السريرية فلويديك غير المتجانسة، يسترد الأسلوب المقترح استمرار أعلاه 95% العَدلات من عينات إفراز مجرى الهواء التي هي تضعف 1,000-fold مع المحلول الملحي نظيفة (~ 1 مل). على النقيض من ذلك، يعرض طريقة تحلل طائفة واسعة من بمنس معدلات الاسترداد استناداً الشرط الذي عينة. يلتقط البروتوكول المقترح الكريات البيضاء بطريقة خالية من التسمية مع لا اضطراب الفيزيائية أو الكيميائية، التي توفر إمكانية لحصاد الخلايا الحساسة من تحدي سريرياً القياسات الحيوية مع إجراءات كسبها.

Protocol

جمع العينات أقرها مجلس جامعة بيتسبرغ المراجعة المؤسسية (IRB # PRO16060443، PRO10110387). جميع التجارب التي تتم تحت السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. 1-جهاز التصنيع والطباعة الحجرية الناعمة ملاحظة: استخدمت تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة الق…

Representative Results

لقد حققنا معلقات الخلايا المناعية شفافة مع كلا DTT موكوليسيس وميكروفلويديكس الانفصال (الشكل 3A). ميكروفلويديكس تفارق جمعت 4.40 × 105 بمنس في المتوسط (2.1 × 104 إلى 5، 60 × 105 بمنس، n = 6) من مجرى الهواء إفراز عينات المخفف 1,000-fold (الحجم الإجمالي 50 مل) في 1 ?…

Discussion

في ميكروفلويديكس القصور الذاتي، تعريب الخلايا والجسيمات في موقف معين جانبية في الدقيقة-قناة استناداً على حجم5،18،،من1920. بسبب التأثير المشترك للعميد سحب قوة وقوة رفع القصور الذاتي في microchannel المنحنية أو الجسيمات الكبير?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة/نييد (R21AI119042) فضلا عن برنامج الفحص “تجنيب عينة U24 المعاهد الوطنية للصحة” (U24-AI118656).

Materials

PDMS precursor Dow corning 184 SIL ELAST KIT 3.9KG 10:1 ratio of base and curing agent
VWR gravity convection oven VWR 414005-128 PDMS precursor to be cured in 90 deg.
100mm petri dish VWR 89000-324 Fabrication of PDMS Supporting layer
Harris Uni-core puncher Sigma-aldrich WHAWB100076 2mm diameter or other depending on the tubing size
Air plasma machine Femto Science Cute Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.
2” x 3” glass slide TED PELLA, INC. 2195 To support PDMS device
Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 Cole-Parmer EW-96410-14 Tubing for microfluidics and peristlatic pump
1/16 inch Luer connector, male Harvard apparatus PC2 72-1443 Connector for fluid guide
50mL Falcon tube Corning 21008-940 sample collection & preparation
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium Corning 45000-446  Buffer solution to dilute sample
Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm HALYARD HEALTH 22113 Tracheal seceation suction catheter
0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe BD PosiFlush NHRIC: 8290-306547 For tracheal seceation collection from the patients
SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL Simport 1176R36 Sterile sputum (airway secretion) collection container
Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL BD BD309604 To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
BD  Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok  Tip BD To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
40µm nylon cell strainer  Falcon 21008-949 To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.
Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) Cole-Parmer HV-07522-30 operation of microfluidics
BD LSR II flow cytometer BD Bioscience LSR II flow cytometer Quantification of cell recovery ratio
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody BD Bioscience 561927 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody BD Bioscience 561864 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Plate reader Thermo Fisher scientific Varioskan Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525
Neutrophil elastase assay kit Cayman Chemical 600610 Neutrophil functionality assessment
Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm PolyScience, Inc. 18140-2 Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics

References

  1. Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
  2. van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
  3. Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
  4. Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
  5. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
  6. Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
  7. Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
  8. Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
  9. Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
  10. Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
  11. Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
  12. Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
  13. Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
  14. Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
  15. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
  16. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  17. Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
  18. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
  19. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
  20. Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
  21. Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
  22. Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
  23. Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
  24. Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
  25. Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
  26. Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).

Play Video

Cite This Article
Ryu, H., Choi, K., Qu, Y., Kwon, T., Lee, J. S., Han, J. Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics. J. Vis. Exp. (136), e57673, doi:10.3791/57673 (2018).

View Video