Summary

Label-free del neutrofilo arricchimento da secrezione di paziente-derivato della via aerea utilizzando microfluidica inerziale Closed-loop

Published: June 07, 2018
doi:

Summary

In questa ricerca, dimostriamo un metodo privo di etichetta del neutrofilo separazione da clinica delle secrezioni bronchiali mediante operazione di ciclo chiuso della microfluidica inerziale a spirale. Il metodo proposto sarebbe espandere i dosaggi clinici in vitro per varie malattie respiratorie.

Abstract

Delle secrezioni bronchiali contengono un gran numero di cellule immuno-correlati, ad esempio, neutrofili, macrofagi e linfociti, utilizzabile come una risorsa importante per valutare una varietà di malattie polmonari, sia per scopi di ricerca e clinici. Tuttavia, a causa della natura eterogenea e viscosa del paziente muco, non c’è attualmente nessun metodo di dissociazione affidabile che non danneggia le cellule immuni ospite nella secrezione paziente delle vie respiratorie. In questa ricerca, vi presentiamo un metodo di preparazione del campione che utilizza microfluidica inerziale per la valutazione del sistema immunitario del paziente. Indipendentemente dalla proprietà fluidica eterogenee dei campioni clinici, il metodo proposto consente di recuperare oltre il 95% dei neutrofili da campioni di secrezione delle vie respiratorie che vengono diluiti 1.000 con millilitri di soluzione fisiologica pulito. Di ricircolo nel flusso di output concentrato al serbatoio del campione iniziale, un’alta concentrazione, il recupero e la purezza delle cellule immunitarie sono forniti; ricircolo è considerato un compromesso per l’operazione di basata su siringa di singolo conduzione della microfluidica inerziale. L’operazione di regolazione della spirale microfluidica fornisce leucociti senza disturbo fisico o chimico, come dimostrato da phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-indotto rilascio dell’elastasi dei neutrofili ordinati.

Introduction

Poiché le celle sono incapsulate in una grande quantità di muco nelle secrezioni delle vie respiratorie, la valutazione funzionale dei leucociti mediante saggio in vitro è stata ostacolata. Ditiotreitolo (DTT) è il più comune buffer di lisi di dissociare e omogeneizzare l’espettorato per l’analisi citologica e rilevamento dei mediatori fornendo al contempo tollerabile attuabilità delle cellule isolate1,2. Tuttavia, DTT può interferire con gli antigeni di superficie associato dei neutrofili delle vie respiratorie, causando l’interruzione della funzione del neutrofilo ad esempio elastasi e mieloperossidasi (MPO) versione2,3. Pertanto, sono stati condotti pochi studi di funzione del neutrofilo umano della via aerea con neutrofili periferici di anima, che non possono rivelare le caratteristiche fisiologiche della polmonare4. Nel frattempo, microfluidica inerzia ha fatto progressi nell’isolare cellule da vari pazienti BIOMATRICI5,6. L’equilibrio tra le forze inerziali ascensore e Dean trascinamento consente di allineare la particella/cella in base alle loro dimensioni, che permette la separazione di particelle privo di etichetta7. Il nostro gruppo precedentemente introdotto un metodo di preparazione del campione per la circolazione del tumore le cellule8,9, agenti patogeni nel sangue8, cellule da una sospensione cultura10,11, 12ed i leucociti polimorfonucleari (PMNs) dal sangue13,14.

Qui, presentiamo un protocollo per preparare le cellule immuni dalle secrezioni delle vie aeree di un paziente con circuito chiuso inerziale microfluidica per un’analisi a valle in vitro , ad esempio, il saggio di elastasi del neutrofilo (NE). Questo metodo fornisce alta concentrazione e il recupero, soprattutto quando c’è una sovrapposizione significativa nella direzione laterale della cella/particella da cui la cellula/particelle di interesse deve essere rimosso, che è osservata comunemente in campioni clinici. Di ricircolo interno parete (IW)-messo a fuoco grandi particelle o cellule torna al tubo di campionamento, la particella o cella di interesse concentrati nel serbatoio originale, mentre fluidi di sfondo con aggregati di piccole mucina passano attraverso il serbatoio di scarico. Nonostante la proprietà fluidica eterogenee dei campioni clinici, il metodo proposto recupera costantemente superiore al 95% dei neutrofili da campioni di secrezione delle vie respiratorie che vengono diluiti 1.000 con una soluzione pulita Salina (~ 1 mL). Al contrario, il metodo di lisi presenta una vasta gamma di PMNs tassi di recupero a seconda delle condizioni del campione. Proposta di protocollo cattura leucociti in modo privo di etichetta senza nessun danno fisico o chimico, che fornisce la possibilità di raccogliere le cellule delicate da clinicamente impegnativo biometria con procedure mini-invasive.

Protocol

La raccolta del campione è stata approvata dall’Università di Pittsburgh Institutional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Tutti gli esperimenti sono eseguiti sotto una cappa di biosicurezza con i dispositivi di protezione personale. 1. dispositivo fabbricazione e Litografia Soft Nota: Litografia soft Standard tecniche15,16 sono stati utilizzati per creare il microchannel di polidimetilsilossano (…

Representative Results

Abbiamo raggiunto trasparente cellula immunitaria sospensioni con entrambi dissociazione di mucolysis e microfluidica DTT (Figura 3A). Dissociazione di microfluidica raccolti in media 4,40 x 105 PMNs (2.1 x 104 a 5.60 x 105 PMNs, n = 6) dalle vie respiratorie secrezione campioni diluiti 1.000 (volume totale di 50 mL) in 1 mL di sospensione pulito. Rispetto per il DILUENTE iniziale, PMNs 94,0% (CD66b+/CD45+</sup…

Discussion

In inerziale microfluidica, particelle e cellule localizzano in una certa posizione laterale in un micro-canale basato sul loro formato5,18,19,20. Dovuto all’effetto combinato del decano trascina la forza e la forza inerziale ascensore nel microchannel curvo, particelle di grandi dimensioni o i neutrofili (> 10 µm) sono situati all’interno del canale e piccole particelle, aggregati di muco e d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIAID (R21AI119042) così come il programma di dosaggio NIH U24 campione con parsimonia (U24-AI118656).

Materials

PDMS precursor Dow corning 184 SIL ELAST KIT 3.9KG 10:1 ratio of base and curing agent
VWR gravity convection oven VWR 414005-128 PDMS precursor to be cured in 90 deg.
100mm petri dish VWR 89000-324 Fabrication of PDMS Supporting layer
Harris Uni-core puncher Sigma-aldrich WHAWB100076 2mm diameter or other depending on the tubing size
Air plasma machine Femto Science Cute Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.
2” x 3” glass slide TED PELLA, INC. 2195 To support PDMS device
Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 Cole-Parmer EW-96410-14 Tubing for microfluidics and peristlatic pump
1/16 inch Luer connector, male Harvard apparatus PC2 72-1443 Connector for fluid guide
50mL Falcon tube Corning 21008-940 sample collection & preparation
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium Corning 45000-446  Buffer solution to dilute sample
Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm HALYARD HEALTH 22113 Tracheal seceation suction catheter
0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe BD PosiFlush NHRIC: 8290-306547 For tracheal seceation collection from the patients
SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL Simport 1176R36 Sterile sputum (airway secretion) collection container
Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL BD BD309604 To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
BD  Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok  Tip BD To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
40µm nylon cell strainer  Falcon 21008-949 To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.
Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) Cole-Parmer HV-07522-30 operation of microfluidics
BD LSR II flow cytometer BD Bioscience LSR II flow cytometer Quantification of cell recovery ratio
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody BD Bioscience 561927 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody BD Bioscience 561864 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Plate reader Thermo Fisher scientific Varioskan Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525
Neutrophil elastase assay kit Cayman Chemical 600610 Neutrophil functionality assessment
Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm PolyScience, Inc. 18140-2 Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics

References

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Cite This Article
Ryu, H., Choi, K., Qu, Y., Kwon, T., Lee, J. S., Han, J. Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics. J. Vis. Exp. (136), e57673, doi:10.3791/57673 (2018).

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