現在、固定細胞の免疫蛍光染色バイオマーカ発現量の定量法選択時は形態情報も必要です。ここに提示されたこのプロトコルは、セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学の別の方法を提供します。
免疫蛍光染色は、現在バイオマーカ発現量の定量のための選択の方法細胞培養系における形態情報も必要です。免疫細胞のパラフィン包埋ブロック、ここに提示された染色プロトコルはパラフィン埋め込まれた固定細胞の免疫蛍光染色に優れた代替手段です。このプロトコルではトロンボプラスチン プラズマ法を用いた HeLa 細胞からパラフィンのセルブロックが準備され、免疫細胞化学 2 つの増殖マーカー、CKAP2 および ki-67 の評価を行った。核と HeLa 細胞の細胞質の形態セル ブロックのスライドでよく保存されていた。同時に、各種の CKAP2 および ki-67 染色パターン パラフィン癌組織免疫組織化学的に非常に類似していた。無血清条件下で HeLa 細胞の前培養を含む変更された細胞培養条件と建築情報を維持しながら効果を評価でした。結論としては、セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学は免疫蛍光染色に優れた代替手段です。
ほとんどの実験室は、通常はセルのパラフィン包埋ブロックは使用されません。むしろ、培養細胞を固定、パラフィン埋め込まれていない細胞は細胞内局在の研究で用いられます。これらの培養細胞を固定、発色ではなく蛍光を使用されています。したがって、免疫蛍光染色細胞文化1を用いた研究ではタンパク質の発現レベルの決定のための選択の方法は、現在。ただし、免疫蛍光染色のために準備されたスライドは、平面顕微鏡2の下で示されたものと違う画像を表示可能性があります蛍光顕微鏡下でのみ観察できます。また、免疫蛍光染色用のスライドの保存は、明るい光からの保護を必要とする、蛍光信号のイメージング蛍光信号3の損失のための繰り返された露出と弱くなります。セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学からの結果は免疫組織のパラフィン包埋4からのそれらにかなり類似と臨床情報に簡単に変換できます。したがって、各種の優れた代替手段となります。ただし、セル ブロック準備されていない人気のある基礎研究所で。このプロトコルでは、その後、セル ブロック作製、免疫染色は、細胞培養研究の分野でこのメソッドの使用を促進するために提供されます。
セル ブロック作製の試みとユニークな方法は、彼らはすでに基礎研究4,5に臨床診断から適用されています。メソッドをされている様々 なセル ブロック準備報告4,6トロンボプラスチン プラズマ法はシンプルでコスト効率の高い、容易に適応可能であります。したがって、トロンボプラスチン プラズマ法4,5,6,7,本稿で提示されたプロトコルの8はセルのパラフィン包埋ブロックの作成に使用されます。
本研究ではトロンボプラスチン プラズマ細胞ブロックおよび 2 つの増殖マーカーを用いた免疫細胞化学法の準備の詳細な手順を示した。1 つのマーカーは最近分裂マーカー9,10,11; として報告されている細胞骨格関連タンパク質 2 (CKAP2)もう一つは Ki 67、最も有名な増殖マーカー12であります。代表的な方式を図 1に示します。
固定細胞の免疫蛍光染色は現在形態情報1を維持しながら細胞におけるタンパク質発現量の定量のための選択の方法です。ただし、セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学は優秀な代わりをすることができます。このプロトコルでセルのパラフィン包埋ブロックの試みとの準備のための詳細な手順が記載されているし、細胞研究のアプリケーションも容易に可能だと思います。
免疫細胞化学には、免疫蛍光染色にいくつかの利点があります。新鮮な培養細胞が必要ですが通常細胞の免疫蛍光染色、パラフィン セル ブロックはいくつかの年13の部屋の温度で保つことができます。さらに、セル ブロックで各種生体4日常的免疫組織化学で使用される同じ抗体を用いて細胞内発現パターンを探索できます。さらに、蛋白質のレベルや、事前培養細胞様々 な薬や様々 な文化の条件11の下で翻訳後修飾の変化を調べることができます。
免疫組織化学染色の利点と対照をなしてセルのパラフィン包埋ブロックの作成は時間がかかり、高価な14です。また、ほとんど研究所この手法で経験が不足して、このような状況の下で技術的なエラーが多い。最も一般的なエラーは、細胞形態の貧しい人々 の保存と貧しいまたは不規則な免疫パラフィン セル ブロック セクションに染色します。これらは、ほとんどの人は、最高のセル条件でセル ブロックを作ったり、細胞塊を形成する十分なソリューションを使用して回避できます。
現在のプロトコルの例として HeLa 細胞のセル ブロックを調製し、, 2 つの増殖マーカー、CKAP2 および以前に報告した11として、ki-67 の免疫細胞化学的染色を行った。各種、メディア牛胎児血清とのインキュベーション操られていた細胞と血清飢餓の影響はみられなかった。スライドあたり 4-5 μ m 厚のセル ブロック セクションのみを使用してセル ブロックから多くのスライドを用意できますので抗体の多数のこれらの準備されたパラフィン埋め込まれたセルのブロックを用いることができます。したがって、表現パターンの 2 つの条件に対応するは、いくつかの異なる抗体を評価できます。CKAP2 のパターンを染色と癌組織がすでにある Ki 67 報告9,10、11,12, 免疫組織化学染色の結果が簡単に評価される、ため、染色パターン免疫組織化学からのそれらにかなり類似していた。
結論としては、免疫染色パラフィン セルブロックの蛍光汚損; に優れた代替手段をすることができます。さらに、それ容易かつ確実に使用できますで形態情報を維持しながら細胞株における発現に関する基礎的研究。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、国立がんセンター、韓国 (1510121) と国立研究財団、韓国 (no から k. かに研究助成金によって支えられた.NRF-2015R1A2A2A04007432)。
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |