حاليا، تلطيخ إيمونوفلوريسسينت على الخلايا الثابتة هو الأسلوب المفضل لتحديد مستويات التعبير البروتين عند المورفولوجية المعلومات ضرورية أيضا. يوفر هذا البروتوكول المعروضة هنا لطريقة بديلة إيمونوسيتوتشيميستري في كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين.
تلوين إيممونوفلوريسسينت حاليا الأسلوب المفضل لتحديد مستويات التعبير البروتين في نظم زراعة الخلايا عند المورفولوجية المعلومات ضرورية أيضا. بروتوكول immunocytochemical تلطيخ في كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين، المقدمة في هذه الوثيقة، بديل ممتاز لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت على الخلايا الثابتة البارافين غير مضمن. في هذا البروتوكول، كتلة بارافين خلية من خلايا هيلا أعد باستخدام الأسلوب ثرومبوبلاستين البلازما، وأجرى إيمونوسيتوتشيميستري لتقييم علامات انتشار اثنين، CKAP2، وكي-67. نوى ومورفولوجيا هيولى خلايا هيلا قد حفظت جيدا في الشرائح من كتلة الخلية. في الوقت نفسه، كانت أنماط المصبوغة CKAP2 وكي-67 في إيمونوسيتوتشيميستري مماثلة تماما لتلك في المناعي تلطيخ في أنسجة السرطان البارافين. مع ظروف زراعة الخلايا المحورة، بما في ذلك الحضانة قبل خلايا هيلا تحت ظروف خالية من المصل، يمكن تقييم التأثير مع الحفاظ على المعلومات المعمارية. وفي الختام، إيمونوسيتوتشيميستري في كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين بديل ممتاز لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت.
كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين في معظم المختبرات، لا تستخدم عادة. بدلاً من ذلك، إصلاح الخلايا المستزرعة، الخلايا غير مضمن البارافين، يعملون في دراسات الترجمة سوبسيلولار. وقد استخدمت لتلك الثابتة الخلايا المستزرعة، fluorescence بدلاً من تشروموجين. ولذلك، تلطيخ إيمونوفلوريسسينت حاليا الأسلوب المفضل لتحديد مستويات التعبير البروتين في البحوث التي تستخدم الثقافات الخلية1. ومع ذلك، يمكن ملاحظة الشرائح المعدة لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت، فقط تحت المجهر إيمونوفلوريسسينت، التي قد تظهر الصور مختلفة تماما عن تلك المشار إليها تحت المجهر الطائرة2. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب الحفاظ على الشرائح لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت الحماية من الضوء الساطع، وإشارات الفلورسنت تصبح أضعف مع التعرض المتكرر للتصوير بسبب فقدان إشارة مضيئة3. النتائج من إيمونوسيتوتشيميستري في كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين مماثلة تماما لتلك من immunohistochemistry على الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين4، وأنها يمكن أن يترجم بسهولة إلى المعلومات السريرية. ولذلك، يمكن أن يكون إيمونوسيتوتشيميستري بديل ممتاز. ومع ذلك، لم يكن إعداد الخلية كتلة شعبية في مختبرات البحوث الأساسية. في هذا البروتوكول، ثم تقدم إعداد كتلة الخلية و immunocytochemical تلطيخ للترويج لاستخدام هذا الأسلوب في مجال دراسات الخلية-الثقافة.
إعداد كتلة الخلايا وإيمونوسيتوتشيميستري ليست أساليب فريدة من نوعها، وأنها فعلا قد تم تطبيقه من التشخيص السريري للبحوث الأساسية4،5. على الرغم من أن إعداد كتلة الخلية مختلف الأساليب قد تم الإبلاغ عن4،الأسلوب6 ثرومبوبلاستين البلازما بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وسهولة التكيف. ولذلك، يستخدم8 في البروتوكول المعروضة في هذه الورقة، أن ثرومبوبلاستين البلازما الأسلوب4،5،،من67،لإعداد كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين.
في هذه الدراسة، وقد عرضت الإجراءات المفصلة لإعداد كتل الخلايا ثرومبوبلاستين البلازما والأسلوب immunocytochemistry توظيف اثنين انتشار علامات. علامة واحدة من البروتينات المرتبطة سيتوسكيليتون 2 (CKAP2)، التي سجلت مؤخرا علامة الانقسامية9،،من1011؛ الآخر هو أن كي-67، الذي هو علامة انتشار شهرة12. ويرد النظام الممثل في الشكل 1.
تلوين إيمونوفلوريسسينت في الخلايا المستزرعة الثابتة حاليا الأسلوب المفضل لتحديد مستوى التعبير البروتين في الخلايا مع الحفاظ على الخصائص المورفولوجية المعلومات1. ومع ذلك، يمكن أن إيمونوسيتوتشيميستري على كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين بديل ممتاز. وقد وصف الإجراءات المفصلة لإعداد كتل جزءا لا يتجزأ من البارافين الخلايا وإيمونوسيتوتشيميستري في هذا البروتوكول، ونأمل أن يمكن أن تسهل تطبيق إيمونوسيتوتشيميستري في الدراسات الخلية.
وقد Immunocytochemistry تلطيخ إيممونوفلوريسسينت العديد من المزايا. تلوين إيمونوفلوريسسينت للخلايا وعادة ما تتطلب الخلايا المستزرعة طازجة، ولكن يمكن الاحتفاظ بكتل الخلايا البارافين في درجة حرارة الغرفة لعدة سنوات13. بالإضافة إلى ذلك، إيمونوسيتوتشيميستري في كتل الخلايا يمكن استكشاف أنماط التعبير داخل الخلايا باستخدام الأجسام المضادة نفسها المستخدمة في إيمونوهيستوتشيميستري الروتينية في الأنسجة البشرية4. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن استكشاف التغيرات في مستويات البروتين أو تعديلات بوستترانسلاشونال أما من قبل حضانة الخلايا مع مختلف العقاقير أو تحت مختلف الظروف الثقافة11.
وعلى النقيض من مزايا immunocytochemical تلطيخ، إعداد كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين يستغرق وقتاً طويلاً وهي مكلفة14. أيضا، معظم بحوث المختبرات تفتقر إلى الخبرة في هذا الأسلوب، وتشيع الأخطاء التقنية في مثل هذه الظروف. الأخطاء الأكثر شيوعاً هي الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا الفقراء والفقراء أو غير النظامية immunocytochemical تلطيخ على الأقسام كتلة الخلية البارافين. يمكن تجنب هذه ومعظم الآخرين بجعل كتل الخلايا في أفضل ظروف الخلية واستخدام الحل ما يكفي لتشكيل جلطات الخلية.
وإظهارا لهذا البروتوكول، وأعدت كتل الخلايا لخلايا هيلا، و immunocytochemical تلطيخ أجريت لاثنين من علامات الانتشار، CKAP2 وكي-67، كما ذكر من قبل11. إيمونوسيتوتشيميستري، تم التلاعب بها الخلايا بالحضانة في وسائل الإعلام مع أو بدون المصل البقري الجنين، ويمكن ملاحظة تأثير المجاعة المصل. ويمكن استخدام هذه الكتل الخلية جزءا لا يتجزأ من البارافين استعداد عدد كبير من الأجسام المضادة، لأنه يمكن إعداد شرائح كثيرة من كتلة خلية فقط قسم 4-5 ميكرومتر سميكة الزنزانات كل شريحة باستخدام. ولذلك، يمكن تقييم أنماط التعبير المطابق لشرطين مختلفة مع العديد من الأجسام المضادة المختلفة. Immunostaining أنماط ل CKAP2 وذكرت أن كي-67 في سرطان الأنسجة قد تم بالفعل9،10،،من1112immunocytochemical تلطيخ النتائج يمكن بسهولة تقييم، نظراً أنماط المصبوغة كانت مماثلة تماما لتلك من إيمونوهيستوتشيميستري.
وفي الختام، immunocytochemical تلطيخ في كتل البارافين خلية يمكن أن تكون بديلاً ممتازا لتلطيخ إيمونوفلوريسسينت؛ وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن بسهولة وبشكل موثوق توظيف في البحوث الأساسية للتعبير التنميط في خطوط الخلايا مع الحفاظ على معلومات الخصائص المورفولوجية.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمها المنح البحثية لمحمد ك. من مركز السرطان الوطني، كوريا (1510121) والمؤسسة الوطنية للبحوث، كوريا (لا. NRF-2015R1A2A2A04007432).
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |