כיום, צביעת immunofluorescent על תאים קבוע הוא שיטת הבחירה לקביעת רמות הביטוי חלבון כאשר מידע מורפולוגי נחוץ גם. פרוטוקול זה שהוצגו במסמך זה מספק שיטה חלופית immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע.
צביעת immunofluorescent נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמות ביטוי החלבון במערכות תרבית תאים כאשר מידע מורפולוגי הוא גם הכרחי. הפרוטוקול של immunocytochemical מכתים על בלוקי תא פרפין-מוטבע, שהוצגו במסמך זה, היא אלטרנטיבה מעולה immunofluorescent מכתים בתאי קבוע-מוטבע פרפין. ב פרוטוקול זה, לתא כלא פרפין מתאי הלה הוכן בשיטת thromboplastin-פלזמה, immunocytochemistry בוצע על ההערכה של שני סמנים התפשטות, CKAP2 ו- Ki-67. הגרעינים cytoplasmic המורפולוגיה של תאי הלה היו השתמר היטב בשקופיות אגף. במקביל, הדפוסים מוכתמים CKAP2 ו- Ki-67 ב- immunocytochemistry היו די דומים לאלו immunohistochemical מכתים ברקמות סרטן פרפין. עם תרבית תאים ששונה תנאים, לרבות קדם דגירה של הלה תאים בתנאים ללא סרום, יוכל להעריך את ההשפעה תוך שמירה על מידע אדריכלי. לסיכום, immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע הוא אלטרנטיבה מצוינת immunofluorescent מכתים.
במעבדות רוב, בלוקי תא פרפין-מוטבע נמצאים בשימוש נפוץ. במקום זאת, קבוע תאים בתרבית, פרפין-מוטבע לא התאים, הם מועסקים בלימודי הסבת subcellular. לאלו קבוע תאים בתרבית, שימש זריחה במקום chromogen. לכן, צביעת immunofluorescent נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמות החלבון ביטוי במחקר העסקת תרבויות תא1. שקופיות שהוכנו עבור צביעת immunofluorescent, עם זאת, ניתן לצפות רק תחת מיקרוסקופ immunofluorescent, אשר עשויה להציג תמונות שונות לחלוטין מאלו המתבקשים תחת מטוס מיקרוסקופ2. בנוסף, שימור שקופיות עבור צביעת immunofluorescent דורש הגנה מפני אור בהיר, ולהיות אותות פלואורסצנט חלשים עם חשיפה חוזרת ונשנית עבור הדמיה בשל האובדן של אותות פלואורסצנט3. תוצאות immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע דומים למדי לאלה של אימונוהיסטוכימיה על רקמות פרפין-מוטבע4, הם יכולים בקלות להיות מתורגם המידע הקליני. לכן, immunocytochemistry יכול להיות חלופה מצוינת. עם זאת, אגף הכנה לא היתה פופולרית במעבדות מחקר בסיסי. ב פרוטוקול זה, ואז, הכנה אגף immunocytochemical מכתים ניתנים כדי לקדם את השימוש בשיטה זו בתחום של לימודי תרבות-תא.
הכנה אגף immunocytochemistry אינן שיטות עבודה ייחודיות ולאחר שכבר החלתם של אבחון קליני מחקר בסיסי4,5. למרות הכנה אגף שונים בשיטות היה דיווח על4,6 thromboplastin-הפלזמה שיטה היא פשוטה, חסכונית, וניתנת להתאמה בקלות. לכן, בפרוטוקול שהוצגו במאמר זה, thromboplastin-פלזמה שיטה4,5,6,7,8 משמש לייצור בלוקי תא פרפין-מוטבע.
במחקר הנוכחי, היו הפגינו את נהלי ההכנה של בלוקי תא thromboplastin-פלזמה ושיטת immunocytochemistry העסקת שני סמנים הפצת נתונים היסטוריים. סמן אחד הוא חלבון שלד התא-הקשורים 2 (CKAP2), אשר לאחרונה דווחה על סמן mitotic9,10,11; השני הוא Ki-67, המהווה סמן התפשטות הידועים12. ערכת נציג מוצג באיור1.
צביעת immunofluorescent על קבוע תאים בתרבית נמצא כעת לשיטת הבחירה לקביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים תוך שמירה על מידע מורפולוגי1. עם זאת, immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע יכול להיות חלופה מצוינת. ההליכים מפורט עבור הכנת בלוקי תא פרפין-מוטבע ו- immunocytochemistry תוארו של פרוטוקול זה, אנו מקווים זה יכול להקל על היישום של immunocytochemistry במחקרים התא.
Immunocytochemistry יש מספר יתרונות על צביעת immunofluorescent. Immunofluorescent מכתים עבור תאים בדרך כלל דורש תאים בתרבית טרי, אבל בלוקי תא פרפין יכול להישמר בטמפרטורת החדר במשך שנים מספר13. בנוסף, immunocytochemistry על בלוקי תא יכולים לחקור דפוסי ביטוי תאיים על ידי העסקת הנוגדן אותו בשימוש שגרתי אימונוהיסטוכימיה ברקמות אנושיות4. יתר על כן, זה יכולים לחקור את השינויים רמות החלבון או שינויים posttranslational גם על ידי מראש המקננת תאים עם תרופות שונות או תחת תנאים שונים של תרבות11.
לעומת היתרונות של immunocytochemical מכתים, הכנת בלוקי תא פרפין-מוטבע לוקח זמן והוא יקר14. כמו כן, רוב מעבדות מחקר חסר ניסיון בטכניקה זו, שגיאות טכניות בנסיבות כאלה נפוצים. מהשגיאות הנפוצות ביותר הן ההשתמרות הדלה תא מורפולוגיה של עני או לא סדיר immunocytochemical מכתים במקטעי בלוק תא פרפין. אלה ואחרים רוב ניתן להימנע על ידי ביצוע בלוקי תא תחת התנאים תא הכי באמצעות פתרון מספיק כדי ליצור תא קרישי דם.
בתור הדגמה של הפרוטוקול הנוכחי, בלוקי תא הוכנו עבור תאים הלה, immunocytochemical מכתים בוצע עבור שני סמנים התפשטות, CKAP2 ו- Ki-67, כפי שדווחה בעבר11. עבור immunocytochemistry, התאים היו המניפולציה של דגירה בתקשורת עם ובלי סרום שור עוברית, השפעת סרום רעב יכול להיות שנצפו. יכול להיות מועסק אלה בלוקי תא פרפין-מוטבע מוכן עבור מספר גדול של נוגדנים, כי ניתן להכין שקופיות רבים לתא כלא באמצעות רק מיקרומטר-עבה-אגף מקטע 4-5 עבור כל שקופית. לכן, ניתן להעריך דפוסי ביטוי המתייחס שני תנאים שונים עם מספר נוגדנים שונים. Immunostaining תבניות עבור CKAP2, Ki-67 סרטן רקמות כבר דיווחו9,10,11,12. immunocytochemical מכתים תוצאות יוכל בקלות להעריך, כי דפוסי מכתימים היו דומים מאוד לאלה של אימונוהיסטוכימיה.
לסיכום, immunocytochemical מכתים על בלוקי תא פרפין יכול להיות אלטרנטיבה מצוינת מכתים immunofluorescent; יתר על כן, זה יכול להיות בקלות ובאמינות מועסק במחקר בסיסי עבור הביטוי פרופיל בשורות תאים תוך שמירה על מידע מורפולוגי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר כדי ק’-מ. ה מרכז הסרטן הלאומי, קוריאה (1510121), קרן מחקר לאומי, קוריאה (לא. NRF-2015R1A2A2A04007432).
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |