Momenteel is de methode van keuze voor gehaltebepaling eiwit expressie immunefluorescentie kleuring op vaste cellen wanneer morfologische ook noodzakelijk is. Dit protocol gepresenteerd hierin voorziet in een alternatieve methode van immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken.
Immunefluorescentie kleuring is momenteel de methode van keuze voor gehaltebepaling eiwit expressie in celkweek systemen wanneer morfologische ook noodzakelijk is. Het protocol van immunocytochemische kleuring op cel paraffine-ingebedde blokken, hier vermelde is een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring op niet-paraffine-ingebedde vaste cellen. In dit protocol, een paraffine cel blok van HeLa cellen werd opgesteld op basis van de thromboplastin-plasma-methode en immunocytochemie werd uitgevoerd voor de beoordeling van twee markeringen van de proliferatie, CKAP2 en Ki-67. De kernen en cytoplasmatische morfologie van de HeLa cellen werden goed bewaard gebleven in de cel-blok dia’s. Tegelijkertijd waren de CKAP2 en Ki-67 kleuring patronen in de immunocytochemie vrij gelijkaardig aan degenen in immunohistochemische kleuring in paraffine kanker weefsels. Met gewijzigde cel-cultuur-voorwaarden, met inbegrip van pre-incubatie van HeLa cellen in serumvrij omstandigheden, kan het effect met behoud van de architectonische informatie worden geëvalueerd. Kortom, is immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring.
In de meeste laboratoria, worden paraffine-ingebedde cel blokken niet vaak gebruikt. Integendeel, vaste gekweekte cellen, niet paraffine-ingebedde cellen, zijn werkzaam in subcellular localisatie studies. Voor deze vaste gekweekte cellen, is fluorescentie in plaats van chromogeen gebruikt. Immunefluorescentie kleuring is daarom op dit moment de methode van keuze voor eiwit expressie gehaltebepaling in onderzoek cel culturen1dienst. Dia’s voorbereid immunefluorescentie kleuring, kunnen echter alleen onder immunefluorescentie microscopie, waaruit zou kunnen beelden heel anders dan die vermeld onder vliegtuig microscopie2worden waargenomen. Daarnaast behoud van dia’s voor immunefluorescentie kleuring vereist bescherming tegen fel licht en fluorescerende signalen worden zwakker met herhaalde blootstelling voor imaging te wijten aan het verlies van de fluorescent signaal3. Resultaten van immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken zijn vrij gelijkaardig aan die van immunohistochemistry op weefsels paraffine-ingebedde4, en ze kunnen gemakkelijk worden omgezet in klinische informatie. Immunocytochemie kan dus een uitstekend alternatief. Echter, cel-blok voorbereiding niet populair geweest in fundamenteel onderzoekslaboratoria. In dit protocol, vervolgens cel-blok voorbereiding en immunocytochemische kleuring worden geleverd ter bevordering van het gebruik van deze methode op het gebied van celkweek studies.
Cel-blok voorbereiding en immunocytochemie zijn geen unieke methoden, en zij hebben al van klinische diagnose toegepast op fundamenteel onderzoek4,5. Hoewel verschillende cel-blok voorbereiding methoden zijn gemeld4,is6 het thromboplastin-plasma methode eenvoudig, rendabel en gemakkelijk aan te passen. Daarom, in het protocol gepresenteerd in deze paper, de thromboplastin-plasma methode4,5,6,7,8 wordt gebruikt voor bereiding van paraffine-ingebedde cel blokken.
In de huidige studie, werden de gedetailleerde procedures voor het opstellen van thromboplastin-plasma cel blokken en de methode van de immunocytochemie twee proliferatie markeringen in dienst gedemonstreerd. Een marker is cytoskelet-geassocieerde proteïne 2 (CKAP2), die onlangs werd gerapporteerd als een mitotische marker9,10,11; de andere is Ki-67, die de bekendste proliferatie marker12 is. Het representatieve stelsel is afgebeeld in Figuur 1.
Immunefluorescentie kleuring op vaste gekweekte cellen is momenteel de methode van keuze voor bepaling van eiwit expressie gehalte in cellen met behoud van morfologische informatie1. Immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken kan echter een uitstekend alternatief. De gedetailleerde procedures voor de bereiding van paraffine-ingebedde cel blokken en immunocytochemie zijn beschreven in dit protocol, en wij hopen dat het de toepassing van immunocytochemie in cel studies kan vergemakkelijken.
Immunocytochemie heeft verschillende voordelen ten opzichte van immunefluorescentie kleuring. Vers gekweekte cellen immunefluorescentie kleuring voor cellen gewoonlijk vereist, maar cel paraffineblokken houdbaar bij kamertemperatuur voor meerdere jaren13. Bovendien kunt immunocytochemie op cel blokken intracellulaire expressiepatronen verkennen door gebruik te maken van het zelfde antilichaam gebruikt in routine immunohistochemistry op menselijke weefsels4. Bovendien vindt het de veranderingen in eiwitniveaus of posttranslationele modificaties hetzij door cellen met verschillende drugs of onder verschillende cultuur voorwaarden11vooraf aan het broeden.
In tegenstelling tot de voordelen van immunocytochemische kleuring, de voorbereiding van paraffine-ingebedde cel blokken kost tijd en is kostbaar14. Ook de meeste onderzoekslaboratoria niet veel ervaring in deze techniek, en technische fouten onder dergelijke omstandigheden gelden. De meest voorkomende fouten zijn arme behoud van cel morfologie en arme of onregelmatige immunocytochemische kleuring op de paraffine cel blok secties. Deze en de meeste anderen kunnen worden vermeden door het maken van cel blokken onder de beste omstandigheden van de cel en gebruiken van genoeg oplossing vormen van cel stolsels.
Als een demonstratie van het huidige protocol, cel blokken waren voorbereid op HeLa cellen, en voor twee markeringen van de proliferatie, CKAP2 en Ki-67, zoals eerder gemeld11immunocytochemische kleuring werd uitgevoerd. De cellen werden gemanipuleerd door incubatie in media met en zonder foetale runderserum immunocytochemie, en het effect van serum honger kon worden waargenomen. Deze blokken bereid paraffine-ingebedde cel kunnen worden gebruikt voor een groot aantal antilichamen, omdat veel glijbanen kunnen bereid worden uit een blok van de cel met behulp van alleen een 4-5 µm dik cel-sectie block per dia. Daarom kunnen expressiepatronen overeenkomt met twee verschillende voorwaarden met verscheidene verschillende antilichamen worden geëvalueerd. De immunokleuring patronen voor CKAP2 en Ki-67 in kanker weefsels reeds gemeld9,10,11,12, en de immunocytochemische kleuring resultaten kan gemakkelijk behandeld worden, omdat de kleuring patronen waren vrij gelijkaardig aan die van immunohistochemistry.
Kortom, kunnen immunocytochemische kleuring op cel paraffineblokken een uitstekend alternatief voor immunefluorescentie kleuring; Bovendien, het kan worden gemakkelijk en betrouwbaar ingezet bij het basisonderzoek voor expressie profilering in cellijnen behoud van morfologische informatie.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door onderzoekssubsidies aan K.-M.H. uit de nationale Cancer Center, Korea (1510121) en de National Research Foundation, Korea (nr. NRF-2015R1A2A2A04007432).
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |