Attualmente, macchiatura immunofluorescente su celle fisse è il metodo di scelta per la determinazione dei livelli di espressione della proteina quando informazioni morfologiche sono anche necessari. Questo protocollo presentato qui fornisce un metodo alternativo di immunocitochimica su blocchi di paraffina delle cellule.
Macchiatura immunofluorescente è attualmente il metodo di scelta per la determinazione dei livelli di espressione della proteina nei sistemi di coltura cellulare quando informazioni morfologiche sono anche necessari. Il protocollo di colorazione su blocchi di paraffina celle, presentati qui, immunocitochimica è un’ottima alternativa alla macchiatura immunofluorescente su celle fisse-paraffina-incastonato. In questo protocollo, un blocco di celle di paraffina da cellule HeLa è stato preparato utilizzando il metodo di tromboplastina-plasma e immunocitochimica è stata eseguita per la valutazione di due marcatori di proliferazione, CKAP2 e Ki-67. I nuclei e citoplasma morfologia delle cellule HeLa sono stati conservati bene nelle diapositive blocchetto delle cellule. Allo stesso tempo, il pattern di colorazione CKAP2 e Ki-67 nell’immunocitochimica erano abbastanza simili a quelle in immunoistochimica in tessuti di cancro di paraffina. Con condizioni di coltura delle cellule modificate, tra cui pre-incubazione delle cellule HeLa in condizioni privo di siero, l’effetto potrebbe essere valutato, preservando le informazioni dell’architettura. In conclusione, immunocitochimica su blocchi di paraffina celle è un’ottima alternativa alla macchiatura immunofluorescente.
Nella maggior parte dei laboratori, blocchi di paraffina celle non sono comunemente utilizzati. Piuttosto, fissa cellule coltivate, cellule non paraffina, sono impiegati negli studi di localizzazione subcellulare. Per quelli fissi cellule coltivate, è stato utilizzato fluorescenza invece di cromogeno. Di conseguenza, macchiatura immunofluorescente è attualmente il metodo di scelta per la determinazione dei livelli di espressione della proteina nella ricerca che impiegano cell culture1. Vetrini preparati per la macchiatura immunofluorescente, tuttavia, possono essere osservate solo nell’ambito di microscopia immunofluorescente, che potrebbe mostrare immagini abbastanza diverse da quelle indicate sotto aereo microscopia2. Inoltre, conservazione delle diapositive per la macchiatura immunofluorescente richiede protezione dalla luce brillante e segnali fluorescenti diventano più deboli con l’esposizione ripetuta per l’imaging a causa della perdita del segnale fluorescente3. Risultati da immunocitochimica su blocchi di paraffina celle sono molto simili a quelli di immunoistochimica su tessuti paraffina-incastonati4, ed essi possono essere facilmente tradotti in informazioni cliniche. Di conseguenza, immunocitochimica può essere un’ottima alternativa. Tuttavia, la preparazione del blocchetto delle cellule non è stato popolare in laboratori di ricerca di base. In questo protocollo, quindi, preparazione del blocchetto delle cellule e la macchiatura immunocytochemical sono disponibili per promuovere l’uso di questo metodo nel campo degli studi della coltura cellulare.
Immunocitochimica e preparazione del blocco di celle non sono metodi univoci, e sono già state applicate dalla diagnosi clinica alla ricerca di base4,5. Anche se la preparazione di blocco di celle vari metodi sono stati riportati4,6 tromboplastina-plasma metodo è semplice, economica e facilmente adattabile. Pertanto, nel protocollo presentato in questa carta, la tromboplastina-plasma metodo4,5,6,7,8 viene utilizzato per la preparazione di blocchi di celle di paraffina.
Nel presente studio, sono state dimostrate le procedure dettagliate per la preparazione di blocchi di celle di tromboplastina-plasma e il metodo di immunocitochimica impiegando due marcatori di proliferazione. Un marker è proteina citoscheletrica associata 2 (CKAP2), che recentemente è stata segnalata come un marcatore mitotica9,10,11; l’altro è Ki-67, che è il più noto di marcatore di proliferazione12. Lo schema rappresentativo è illustrato nella Figura 1.
Macchiatura immunofluorescente su cellule in coltura fisse è attualmente il metodo di scelta per la determinazione del livello di espressione della proteina in cellule mantenendo informazioni morfologiche1. Tuttavia, immunocitochimica su blocchi di paraffina delle cellule può essere un’ottima alternativa. Le procedure dettagliate per la preparazione di blocchi di celle di paraffina e immunocitochimica sono stati descritti nel presente protocollo, e speriamo che può facilitare l’applicazione di immunocitochimica in studi delle cellule.
Immunocitochimica presenta parecchi vantaggi sopra macchiatura immunofluorescente. Macchiatura immunofluorescente per cellule solitamente richiede celle appena colture, ma blocchi di celle di paraffina possono essere mantenuti a temperatura ambiente per diversi anni13. Inoltre, immunocitochimica su blocchi di celle possibile esplorare modelli di espressione intracellulare impiegando lo stesso anticorpo utilizzato in routine immunoistochimica su tessuti umani4. Inoltre, possono esplorare i cambiamenti nei livelli di proteina o modifiche di posttranslational sia pre-incubando le cellule con le varie droghe o sotto varie condizioni di cultura11.
In contrasto con i vantaggi di macchiatura immunocytochemical, la preparazione di blocchi di celle paraffina richiede tempo ed è costosa14. Inoltre, maggior parte dei laboratori di ricerca mancano di esperienza in questa tecnica, ed errori tecnici in tali circostanze sono comuni. Gli errori più comuni sono povera conservazione della morfologia delle cellule e colorazione sulle sezioni di blocco di paraffina cella di immunocitochimica scarsa o irregolare. Questi e molti altri utenti può essere evitati effettuando blocchi di celle sotto le migliori condizioni di cella e con soluzione abbastanza per formare coaguli di cella.
Come una dimostrazione del presente protocollo, blocchetti delle cellule sono state preparate per cellule HeLa e macchiatura immunocytochemical è stata effettuata per i due marcatori di proliferazione, CKAP2 e Ki-67, come precedentemente segnalato11. Per immunocitochimica, le cellule sono state manipolate tramite incubazione in media con e senza siero bovino fetale, e l’effetto di deprivazione di siero potrebbe essere osservato. Questi blocchi di celle di paraffina preparato possono essere impiegati per un gran numero di anticorpi, perché molte diapositive possono essere preparate da un blocco di celle utilizzando solo una sezione di blocco di celle µm di spessore di 4-5 per ogni diapositiva. Pertanto, i modelli di espressione corrispondente a due diverse condizioni possono essere valutati con diversi anticorpi differenti. Modelli di immunostaining per CKAP2 e Ki-67 nel carcinoma tessuti sono già stati segnalati9,10,11,12, e i risultati di macchiatura immunocytochemical potrebbe essere facilmente valutato, perché il pattern di colorazione erano abbastanza simili a quelli da immunohistochemistry.
In conclusione, immunocytochemical che macchia su blocchetti di paraffina delle cellule può essere un’ottima alternativa alla macchiatura immunofluorescente; Inoltre, esso può essere facilmente e in modo affidabile impiegato nella ricerca di base per l’espressione genica in linee cellulari mantenendo informazioni morfologiche.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da borse di ricerca a K.-M.H. dal National Cancer Center, Korea (1510121) e National Research Foundation, Corea (no. NRF-2015R1A2A2A04007432).
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |