Summary

Expresión de antígenos exógenos en la vacuna de BCG de Mycobacterium bovis por genética no decoración de superficie con el sistema avidina-biotina

Published: January 31, 2018
doi:

Summary

Se presenta una nueva técnica para la visualización rápida de antígeno en una superficie bacteriana, que implica la Biotinilación superficial seguida por la exposición a las proteínas de interés en fusión con avidina monomérica. Carga del BCG con antígenos seleccionados con éxito mejora su inmunogenicidad, lo que sugiere que la decoración superficial puede sustituir los métodos genéticos tradicionales.

Abstract

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa grave y el bacilo de M. bovis sólo disponible vacuna de Calmette-Guerin (BCG) es seguro y eficaz para la protección contra la meningitis de TB severa de los niños y algunas formas de tuberculosis diseminada, pero no protege contra la tuberculosis pulmonar, que es la forma más prevalente de la enfermedad. Estrategias prometedoras para mejorar la BCG en la actualidad basan en su transformación con genes que codifican inmunodominante M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos o complementación con genes que codifican factores que estimularían el antígeno las células presentadoras. Principales limitaciones de estos enfoques incluyen el incierto nivel de seguridad de los vectores de expresión, baja eficiencia y baja estabilidad. En este estudio, presentamos un enfoque alternativo a la mejora de la vacuna, que consiste en complementación de BCG con proteínas exógenas de interés en la superficie de las bacterias, en lugar de transformación con los plásmidos codifican genes correspondientes. En primer lugar, las proteínas de interés se expresan en fusión con avidina monomérica en estándar e. coli sistemas de expresión y utilizarlas para decorar la superficie de biotinilado BCG. Con superficie de BCG con antígenos de sustituta ovoalbúmina los experimentos con animales demuestran que la bacteria modificada completamente inmunogénica y capaces de inducir respuestas de células T específicas. En conjunto, los datos presentados aquí fuertemente apoyan un novedoso y eficaz método para remodelar la actual vacuna BCG que reemplaza el enfoque convencional laborioso de complementación con ácidos nucleicos exógenos.

Introduction

Diversas estrategias se han propuesto para reemplazar la actual vacuna TB BCG, incluyendo proteína adyuvante sistemas, tecnologías virales virales, cepas de m. vivo atenuadas y modificadas genéticamente cepas de BCG, ya sea para introducir genes sobre-expresan antígenos de BCG que no expresan suficientemente durante la infección1 o Mtb-antígenos específicos no presentan en BCG2. Ingeniería genética, sin embargo, se enfrenta a muchas barreras incluyendo el incierto nivel de seguridad, el proceso desperdiciador de tiempo y la baja eficiencia de expresión vectores4,5. Con respecto a la mejora de la BCG, es necesario un enfoque alternativo para mejorar la inmunogenicidad sin necesidad de alteraciones genéticas inciertos.

En este estudio, presentamos una nueva estrategia para la visualización de proteínas recombinantes de interés en la superficie celular de BCG que se basa en la interacción bien conocida de alta afinidad de avidina con biotina. Este enfoque permite el accesorio rápido y reproducible avidina recombinante de proteínas de fusión en la superficie de biotinilado BCG, que facilita las manipulaciones amplia de BCG para lograr un perfeccionamiento máximo de su eficacia manteniendo su excelente seguridad registro, observado durante décadas de uso.

Avidina afinidad para la biotina es extremadamente alta (Kd = 10−15 M) y una vez formado, el complejo biotina-avidina es muy estable y sólo puede ser interrumpido bajo desnaturalizar condiciones6. Sin embargo, para este tipo de interacción para servir como una alternativa de método de transferencia génica, exposición a largo plazo pero reversible de proteínas recombinantes se requiere. Por lo tanto, aquí presentamos una avidina monomérica de baja afinidad (Kd = 10−7 M) que conduce a la liberación reversible de la proteína de la superficie decorada BCG una vez ingerido dentro de las células presentadoras de antígeno. Con el fin de proporcionar una prueba de concepto, probamos este método utilizando una proteína quimérica de avidina monomérica corresponde a un antígeno de sustituto derivado de ovoalbúmina (OVA)7,8. Los resultados mostraron que la superficie de la célula de BCG puede ser fácilmente y rápidamente decorada con proteínas de fusión de avidina monomérica y que esta Unión a la superficie de la BCG es estable y reproducible sin cambios perceptibles en el crecimiento bacteriano y la supervivencia. También, encontramos que la BCG con avidina monomérica con óvulos (AviOVA) puede inducir una respuesta inmune similar a la inducida por la BCG genéticamente expresando el mismo antígeno tanto in vitro como in vivo. Esta tecnología de pantalla reversible de proteínas de interés en la superficie bacteriana es un efectivo reemplazo de enfoques de transferencia génica tradicional y puede proporcionar una plataforma para grandes manipulaciones de BCG y otras aplicaciones de vacuna desarrollo.

Protocol

Todos los animales fueron mantenidos según los protocolos aprobados por los comités de uso en la Universidad de British Columbia y de Animal Care. Experimentos fueron aprobados por los comités de uso y de cuidado Animal y realiza de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal. El número de bienestar animal seguro es A11-0247. 1. generación de proteínas de fusión de avidina monomérica expresando plásmidos El clon avidina monomérica secuencia<sup cla…

Representative Results

Con los procedimientos generales descritos anteriormente, se examinó la viabilidad de Biotinilación superficial de BCG y la decoración con antígenos de sustituta OVA. La inmunogenicidad de la BCG modificada entonces fue probado in vivo. La superficie bacteriana fácilmente fue marcada con biotina para la visualización rápida de antígenos quiméricos avidina sin ningún cambio perceptible en fenotipos bacterianos. El BCG modificado resultante se ingiere eficientemente por l…

Discussion

Reportamos en este estudio un enfoque no genéticos para la visualización rápida y eficaz de proteínas exógenas en superficie de BCG para añadir antígenos específicos o propiedades funcionales específicas previstos mejorar eficientemente la inmunogenicidad de la bacteria. Hemos demostrado que la superficie de la célula de BCG podría ser fácilmente biotinilado para decoración instantánea de la superficie con proteínas de fusión de la avidina. El procedimiento total puede realizarse dentro de 2 h, mientras q…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Dr. R Stokes para la cepa BCG Pasteur y Talal A. para soporte técnico. También agradecemos GenScript ayuda con síntesis del gene.

Materials

Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD  BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb  BD Bioscience  562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG  Electron Microscopy Sciences  25100
Middlebrook 7H9 broth  BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines  American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

References

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Cite This Article
Liao, T. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

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