Summary

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Published: January 31, 2018
doi:

Summary

Una nuova tecnica per la visualizzazione rapida dell’antigene su una superficie batterica è presentata, che coinvolge la superficie biotinylation seguita dall’esposizione alle proteine di interesse in fusione con avidina monomerico. Caricamento di BCG con antigeni selezionati correttamente, migliora la sua immunogenicità, suggerendo che la decorazione di superficie può sostituire tradizionali approcci genetici.

Abstract

Tubercolosi (TB) è una malattia infettiva grave e il bacillo di M. bovis vaccino disponibile solo Calmette-Guérin (BCG) è sicuro ed efficace per la protezione contro la meningite di TB severa per bambini e alcune forme di TB diffusa, ma non riesce a proteggere contro la tubercolosi polmonare, che è la forma più diffusa della malattia. Strategie più promettenti per migliorare BCG attualmente si basano sia sulla sua trasformazione con geni codificanti immunodominanti M. tuberculosis (Mtb)-antigeni specifici e/o complementazione con geni codificanti co-fattori di che stimolerebbero l’antigene cellule presentanti. Principali limiti di questi approcci includono bassa efficienza, bassa stabilità e l’incerto livello di sicurezza dei vettori di espressione. In questo studio, presentiamo un approccio alternativo al miglioramento di vaccino, che consiste di complementazione di BCG con proteine esogene di interesse sulla superficie dei batteri, piuttosto che la trasformazione con plasmidi codifica geni corrispondenti. In primo luogo, le proteine di interesse sono espressi in fusione con avidina monomerica in standard Escherichia coli sistemi di espressione e quindi utilizzato per decorare la superficie di biotinylated BCG. Utilizzando BCG superficie decorata con antigene ovoalbumina surrogato gli esperimenti sugli animali dimostrano che il batterio modificato è completamente immunogenico e capace di indurre risposte delle cellule T specifiche. Complessivamente, i dati presentati qui fortemente sostengono un romanzo e un metodo efficiente per rimodellare l’attuale vaccino BCG che sostituisce l’approccio convenzionale laborioso di complementazione con acidi nucleici esogeni.

Introduction

Sono state proposte varie strategie per sostituire l’attuale vaccino BCG, inclusi sistemi proteici adiuvante, tecnologie basato su vettori virali, ceppi di M.tb vivo attenuati e geneticamente ceppi di BCG, sia per introdurre geni di TB che iper-esprimono gli antigeni di BCG che non sono sufficientemente espressi durante infezione1 o Mtb-antigeni specifici non presentano in BCG2. Ingegneria genetica, tuttavia, affronta molte barriere tra cui l’incerto livello di sicurezza, il processo che richiede tempo e la bassa efficienza di vettori di espressione4,5. Per quanto riguarda il miglioramento BCG, è necessario un approccio alternativo per migliorare immunogenicità senza la necessità di alternanze genetiche incerti.

In questo studio, presentiamo una nuova strategia per la visualizzazione di proteine ricombinanti di interesse sulla superficie della cellula di BCG che si basa sull’interazione ben noto ad alta affinità avidina con biotina. Questo approccio permette di attacco rapido e riproducibile di proteine di fusione ricombinante avidina sulla superficie di biotinylated BCG, che facilita la vaste manipolazioni di BCG per conseguire il miglioramento massimo della sua efficacia pur mantenendo la sicurezza eccellente registrare, osservato in decenni di utilizzo.

Affinità avidina biotina è estremamente alta (Kd = 10− 15 M) e una volta che formato, il complesso avidina-biotina è molto stabile e può essere interrotta solo sotto condizioni6di denaturazione. Tuttavia, per questo tipo di interazione per servire come un’alternativa di metodo di trasferimento gene, esposizione a lungo termine ma reversibile di proteine ricombinanti è richiesto. Così, abbiamo qui introdotto un avidina monomerico bassa affinità (Kd = 10− 7 M) che conduce al rilascio reversibile della proteina dalla superficie decorata BCG una volta ingeriti all’interno di cellule presentanti l’antigene. Al fine di fornire una prova di concetto, abbiamo testato questo metodo utilizzando una proteina chimerica monomerico avidina corrispondente ad un antigene di surrogato derivato da ovoalbumina (uova)7,8. I risultati hanno mostrato che la superficie della cellula di BCG può essere facilmente e rapidamente decorata con proteine di fusione di avidina monomerico e che questa associazione alla superficie di BCG è stabile e riproducibile senza variazioni rilevabili in crescita batterica e la sopravvivenza. Inoltre, abbiamo trovato che BCG decorato con avidina monomerico fuso con ovuli (AviOVA) può indurre una risposta immunitaria simile a quella indotta da BCG geneticamente che esprimono l’antigene stesso sia in vitro che in vivo. Questa tecnologia di schermo reversibile di proteine di interesse sulla superficie batterica è pertanto un efficace sostituto di gene tradizionale trasferimento approcci e può fornire una piattaforma per ulteriori applicazioni nel vaccino e ampia manipolazioni di BCG sviluppo.

Protocol

Tutti gli animali sono stati mantenuti secondo protocolli approvati dalle commissioni di utilizzo presso la University of British Columbia e cura degli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dalle commissioni di utilizzo e cura degli animali ed eseguiti secondo il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali. Il numero di benessere animale assicurazione è A11-0247. 1. generazione di proteine di fusione di avidina monomerico esprimendo plasmidi Sub-clonare monom…

Representative Results

Con le procedure generali descritte sopra, è stata esaminata la fattibilità di BCG superficie biotinylation e decorazione con antigene surrogato OVA. L’immunogenicità del BCG modificate è stato poi testato in vivo. La superficie batterica è stato facilmente etichettata con biotina per la visualizzazione rapida di antigeni chimerico avidina senza modifiche rilevabili nei fenotipi batterici. Il BCG modificate risultante viene ingerito efficientemente dalle cellule di presentaz…

Discussion

Abbiamo segnalato in questo studio un approccio non-genetica per visualizzazione rapida ed efficace delle proteine esogene sulla superficie di BCG per aggiungere gli antigeni specifici o specifiche proprietà funzionali dovuto migliorare in modo efficiente l’immunogenicità del batterio. Abbiamo dimostrato che la superficie della cellula di BCG potrebbe essere facilmente biotinilato per decorazione di superficie istantanea con proteine di fusione di avidina. La procedura totale può essere eseguita entro 2 h, mentre la t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Dr. R Stokes per il ceppo di BCG Pasteur e r. Talal per il supporto tecnico. Ringraziamo anche GenScript per aiuto con sintesi di geni.

Materials

Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD  BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb  BD Bioscience  562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG  Electron Microscopy Sciences  25100
Middlebrook 7H9 broth  BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines  American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

References

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Liao, T. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

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