Summary

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Published: January 31, 2018
doi:

Summary

Eine neuartige Technik für schnelle Antigen-Anzeige auf eine bakterielle Oberfläche präsentiert, die Oberfläche Biotinylierungen, gefolgt von Exposition gegenüber Proteine des Interesses an Fusion mit Monomeren Avidin beinhaltet. Laden von BCG mit ausgewählten Antigene erfolgreich verbessert seine Immunogenität, was darauf hindeutet, dass Oberflächendekoration traditionelle gentechnische Ansätze ersetzen kann.

Abstract

Tuberkulose (TB) ist eine schwere Infektionskrankheit und die einzige verfügbare Impfstoff M. Bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ist sicher und wirksam für Schutz gegen Kinder schwere TB Meningitis und einige Formen von disseminierter TB, aber schützt nicht gegen Lungentuberkulose die häufigste Form der Erkrankung ist. Vielversprechende Strategien zur Verbesserung der BCG derzeit verlassen entweder auf ihre Transformation mit Genen Codierung immundominante M. Tuberculosis (Mtb)-spezifische Antigene und/oder Ergänzung mit Genen Codierung Co-Faktoren, die Antigen stimulieren würde Zellen zu präsentieren. Wesentliche Einschränkungen zu diesen Ansätzen zählen geringe Effizienz, geringe Stabilität und das ungewisse Sicherheitsniveau der Expressionsvektoren. In dieser Studie stellen wir einen alternativen Ansatz zur Impfstoff-Verbesserung, bestehend aus BCG Ergänzung mit exogene Proteine auf der Oberfläche der Bakterien, sondern als Transformation mit entsprechenden Gene Kodierung Plasmide. Erstens interessierender Proteine in Verschmelzung mit Monomeren Avidin im standard E. Coli ausgedrückt werden Expressionssysteme und dann verwendet, um die Oberfläche der biotinylierte BCG zu schmücken. Tierversuche mit BCG Oberfläche verziert mit Surrogat Ovalbumin Antigen nachweisen, dass das geänderte Bakterium vollständig immunogen und in der Lage, spezifische T-Zell-Reaktionen induzieren. Insgesamt unterstützen nachdrücklich die hier vorgestellten Daten eine neuartige und effiziente Methode für die Neugestaltung der aktuellen BCG-Impfstoff, die den mühsamen konventionellen Ansatz der Ergänzung durch exogene Nukleinsäuren ersetzt.

Introduction

Verschiedene Strategien sind vorgeschlagen worden, um die aktuelle TB-Impfstoff BCG, einschließlich Protein adjuvante Systeme, virale vektorieller Technologien, abgeschwächte live M.tb Stämme und genetisch veränderten BCG-Stämmen entweder Gene einzuführen zu ersetzen über Ausdruck BCG-Antigene, die während der Infektion1 oder Mtbnicht hinreichend zum Ausdruck-spezifische Antigene bei BCG2nicht vorhanden. Gentechnik, steht jedoch viele Hindernisse einschließlich der unsicheren Ebene der Sicherheit, die zeitraubende und die geringe Effizienz der Ausdruck Vektoren4,5. Im Hinblick auf die Verbesserung der BCG, ist ein alternativer Ansatz zur Immunogenität ohne die Notwendigkeit einer unsicheren genetische Alternationen Verbesserung notwendig.

In dieser Studie stellen wir eine neue Strategie für die Anzeige der rekombinante Proteine auf der Zelloberfläche von BCG, die auf die bekannte hohe Affinität Avidin Interaktion mit Biotin basiert. Dieser Ansatz ermöglicht schnelle und reproduzierbare Befestigung des rekombinanten Avidin Schmelzverfahren Proteine auf der Oberfläche der biotinylierte BCG, die breitere Manipulationen von BCG, maximale Verbesserung ihrer Wirksamkeit unter Beibehaltung seiner ausgezeichneten Sicherheit zu erreichen erleichtert Zeichnen Sie auf, über Jahrzehnte beobachtet.

Avidin Affinität für Biotin ist extrem hoch (Kd = 10−15 M) und sobald gebildet, die Avidin-Biotin-Komplex ist sehr stabil und kann nur unter denaturierenden Bedingungen6gestört werden. Für diese Art der Interaktion, als gen-Transfer-Methode Alternative zu dienen, ist jedoch langfristig aber reversibel Anzeige von rekombinanten Proteinen erforderlich. Damit wir hier eine geringe Affinität Monomeren Avidin eingeführt (Kd = 10−7 M) führt zur reversiblen Freisetzung des Proteins von der Oberfläche BCG einmal eingenommen innen antigenpräsentierende Zellen versehen. Um ein Proof of Concept zu bieten, haben wir diese Methode mit einem Monomeren Avidin Chimären Protein entspricht ein Surrogat-Antigen abgeleitet von Ovalbumin (OVA)7,8getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die BCG-Zelle-Oberfläche einfach und schnell mit Monomeren Avidin Fusionsproteine dekoriert werden kann und dass diese Bindung an die BCG-Oberfläche stabil und ohne erkennbare Veränderungen in bakterielles Wachstum und überleben reproduzierbar ist. Auch wir fanden, dass BCG dekoriert mit Monomeren Avidin fusioniert mit Eizellen (AviOVA) eine ähnlich dem von BCG induzierte Immunantwort induzieren kann genetisch dasselbe Antigen ausdrücken in Vitro und in Vivo. Diese Technologie umschaltbare Anzeige der Proteine des Interesses auf der bakteriellen Oberfläche ist daher eine effektive Ersatz von traditionellen gen Übertragung Ansätze und kann bieten eine Plattform für breiten Manipulationen der BCG und weitere Anwendungen im Impfstoff Entwicklung.

Protocol

Alle Tiere wurden entsprechend Protokolle vom Animal Care und Nutzung Ausschüsse an der University of British Columbia genehmigt gewartet. Experimente wurden von Animal Care und Nutzung Ausschüsse genehmigt und nach dem Canadian Council auf Animal Care Richtlinien durchgeführt. Die tierischen Qualitätssicherung Wohlfahrt ist A11-0247. 1. Generation von Monomeren Avidin Fusionsproteinen Plasmide zum Ausdruck zu bringen Sub-Klonen Monomeren Avidin Sequenz12 …

Representative Results

Mit den oben beschriebenen allgemeinen Verfahren wurde die Machbarkeit von BCG Oberfläche Biotinylierungen und Dekoration mit Surrogat Antigen Eizellen untersucht. Die Immunogenität der modifizierten BCG war dann in Vivogetestet. Die bakterielle Oberfläche war leicht mit Biotin für schnelle Anzeige der Avidin Chimären Antigene ohne nachweisbaren Veränderungen in bakteriellen Phänotypen gekennzeichnet. Die daraus resultierenden veränderte BCG wird effizient von Antigen-Pr?…

Discussion

In dieser Studie berichten wir einen nicht-genetische Ansatz für schnelle und effektive Darstellung der exogene Proteine auf BCG Oberfläche hinzufügen entweder spezifische Antigene oder bestimmte funktionale Eigenschaften erwartet, dass das Bakterium Immunogenität effizient zu verbessern. Wir bewiesen, dass die BCG-Zelloberfläche biotinylierte für sofortige Oberflächendekoration mit Avidin Fusionsproteine leicht sein könnte. Das gesamte Verfahren kann innerhalb von 2 h, während genetische Veränderung und Selekt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. R Stokes für die BCG Pasteur Belastung und A. Talal für den technischen Support. Wir danken auch GenScript für Hilfe bei der Gensynthese.

Materials

Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD  BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb  BD Bioscience  562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG  Electron Microscopy Sciences  25100
Middlebrook 7H9 broth  BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines  American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

References

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Liao, T. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

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