Summary

التعبير عن "المستضدات خارجية المنشأ" في لقاح BCG متفطره bovis عبر "زخرفة سطح" عدم الوراثية مع نظام عبدين-البيوتين

Published: January 31, 2018
doi:

Summary

تقنية جديدة لعرض مستضد السريع على سطح البكتيريا يرد، الذي ينطوي على سطح بيوتينيليشن يليه التعرض للبروتينات ذات الاهتمام في الانصهار مع عبدين أحادي. تحميل بي سي جي مع المستضدات المحدد بنجاح يحسن به الاستمناع، مما يوحي بأن الزخرفة السطحية يمكن استبدال النهج الوراثية التقليدية.

Abstract

الدرن (السل) هو مرض معد خطير وعصية M. bovis لقاح متوفر فقط لقاح السل (BCG) هو آمنة وفعالة للحماية ضد شديدة السل التهاب السحايا الأطفال وبعض أشكال السل نشرها، ولكن فشل لحماية ضد السل الرئوي، الذي هو الشكل الأكثر شيوعاً للمرض. استراتيجيات واعدة لتحسين BCG حاليا تعتمد أما على تحولها مع الجينات ترميز إيمونودومينانت م. السل (Mtb)-المستضدات محددة و/أو التكامل مع الجينات ترميز المشارك من العوامل التي تحفز مستضد عرض الخلايا. وتشمل القيود الرئيسية لهذه النهج كفاءة منخفضة ومنخفضة الاستقرار ومستوى سلامة ناقلات التعبير غير مؤكد. في هذه الدراسة، نقدم نهج بديل لتحسين اللقاح، الذي يتألف من التكامل بي سي جي مع البروتينات الخارجية ذات الاهتمام على سطح البكتيريا، بدلاً من التحول مع البلازميدات ترميز الجينات المقابلة. أولاً، يتم التعبير عن البروتينات ذات الاهتمام في الانصهار مع عبدين أحادي في معيار كولاي نظم التعبير وتستخدم بعد ذلك لتزيين سطح بيوتينيلاتيد بي سي جي. استخدام سطح BCG مزينة مستضد ovalbumin مركب التجارب على الحيوانات تبين أن بكتيريا معدلة مكسبه تماما وقادرة على استحثاث استجابات محددة T الخلية. بالإجمال، دعم البيانات المعروضة هنا بشدة الرواية والأسلوب كفاءة لإعادة تشكيل لقاح BCG الحالي الذي يحل محل النهج التقليدي شاقة للتكامل مع الأحماض النووية الخارجية.

Introduction

واقترحت استراتيجيات مختلفة ليحل محل لقاح السل الحالية ضد السل، بما في ذلك البروتين adjuvant النظم والتكنولوجيات فيكتوريد الفيروسية والموهنة الحية سلالات M.tb وسلالات السل المحورة وراثيا، أما إدخال جينات الإفراط معربا عن المستضدات السل التي لا يتم التعبير عنها بما فيه الكفاية خلال العدوى1 أو المواضيع المتميزة-المستضدات المحددة غير موجودة في البي سي جي2. الهندسة الوراثية، مع ذلك، يواجه العديد من العوائق، بما في ذلك مستوى السلامة وعملية تستغرق وقتاً طويلاً، وانخفاض كفاءة التعبير ناقلات4،5غير مؤكد. فيما يتعلق بتحسين BCG، مطلوب نهج بديلة لتحسين الاستمناع دون الحاجة للتغييرات الجينية غير مؤكد.

في هذه الدراسة، نقدم استراتيجية رواية لعرض بروتينات المؤتلف من الفائدة على سطح الخلية BCG يستند التفاعل المعروفة عالية تقارب avidin مع البيوتين. ويسمح هذا النهج مرفق السريع واستنساخه من عبدين المؤتلف الانصهار البروتينات على سطح بيوتينيلاتيد ضد السل، مما يسهل التلاعب الواسع للسل لتحقيق تحسين فعاليته القصوى مع الحفاظ على سلامتها ممتازة تسجيل، لوحظ على مدى عقود الاستخدام.

ألفه عبدين البيوتين مرتفعة للغاية (كد = 10−15 م) وحالما تتشكل، المجمع البيوتين-عبدين مستقرة جداً، ويمكن أن تتعطل فقط تحت ظروف6يشوه. ومع ذلك، لهذا النوع من التفاعل مثابة بديل أسلوب نقل جينات، عرض طويلة الأجل ولكن عكسها البروتينات المؤتلف مطلوب. وهكذا قدمنا هنا من عبدين أحادي تقارب منخفضة (كد = 10−7 م) أن يؤدي إلى الإفراج عن عكسها للبروتين من السطح زينت BCG بلعها مرة واحدة داخل مستضد عرض الخلايا. من أجل توفير دليل على المفهوم، قمنا باختبار هذا الأسلوب استخدام أحادي avidin بروتين تشيميريك تناظر مركب مستضد المستمدة من7،أوفالبومين (OVA)8. وأظهرت النتائج أن سطح الخلية BCG يمكن أن زينت بسهولة وسرعة مع البروتينات الانصهار avidin أحادي وأن هذا الربط إلى السطح BCG مستقرة واستنساخه بدون تغييرات لا يمكن اكتشافها في النمو البكتيري والبقاء على قيد الحياة. أيضا، وجدنا أن BCG مزينة avidin أحادي تنصهر مع البويضات (أفيوفا) يمكن أن تحدث استجابة مناعية مشابهة لتلك الناجمة عن السل وراثيا معربا عن مستضد نفسه على حد سواء في المختبر و في فيفو. هذه التكنولوجيا لعرض عكسها للبروتينات للفائدة على سطح البكتيريا ولذلك هو بديل فعال للنهج نقل الجينات التقليدية ويمكن أن توفر منبرا للتلاعب الواسع للسل ومزيد من التطبيقات في اللقاحات التنمية.

Protocol

وأبقى على جميع الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة برعاية الحيوان واستخدام اللجان في جامعة كولومبيا البريطانية. تجارب وافق عليها العناية بالحيوان واستخدام اللجان وتنفيذها وفقا “المجلس الكندي للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان”. هو عدد رعاية الحيوان ضمان A11-0247. 1-جيل بروتينا…

Representative Results

مع الإجراءات العامة المذكورة أعلاه، تم بحث جدوى BCG بيوتينيليشن السطحية والديكور مع مستضد مركب البويضات. كان الاستمناع للسل تم التعديل ثم اختبارها في فيفو. سطح البكتيرية وصفت بسهولة مع البيوتين للعرض السريع المستضدات عبدين تشيميريك دون أي تغييرات يمكن اكتشافها في ت?…

Discussion

أبلغنا في هذه الدراسة نهجاً غير وراثية للعرض السريع والفعال للبروتينات الخارجية على سطح BCG لإضافة مولدات معينة أو محددة الخصائص الفنية التي من المتوقع أن يحسن كفاءة الاستمناع للبكتيريا. أظهرنا أن سطح الخلية BCG يمكن بسهولة بيوتينيلاتيد للزخرفة السطحية لحظية مع عبدين الانصهار البروتينات. ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور R ستوكس لسلالة البي سي جي باستير وطلال أ للدعم التقني. ونشكر أيضا جينسكريبت للمساعدة في تركيب الجينات.

Materials

Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD  BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb  BD Bioscience  562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG  Electron Microscopy Sciences  25100
Middlebrook 7H9 broth  BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines  American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

References

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Play Video

Cite This Article
Liao, T. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

View Video