Summary

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

Published: January 31, 2018
doi:

Summary

Uma nova técnica para antígeno rápida exposição sobre uma superfície bacteriana é apresentada, que envolve a superfície biotinylation seguido por exposição às proteínas de interesse em fusão com avidin monomérico. Carregando a BCG com antígenos selecionados com êxito melhora sua imunogenicidade, sugerindo que a decoração de superfície pode substituir abordagens genéticas tradicionais.

Abstract

Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa grave e o bacilo da vacina disponível apenas M. bovis Calmette-Guérin (BCG) é segura e eficaz para proteção contra meningite de TB infantil grave e algumas formas de tuberculose disseminada, mas não consegue proteger contra a tuberculose pulmonar, que é a forma mais prevalente da doença. Promissoras para melhorar BCG atualmente confiam na sua transformação com genes que codificam imunodominantes M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos e/ou complementação com genes que codificam co-fatores que estimulam o antígeno apresentação de células. Maiores limitações para essas abordagens incluem baixa eficiência e baixa estabilidade do nível incerto de segurança de vetores de expressão. Neste estudo, apresentamos uma abordagem alternativa para melhoria da vacina, que consiste de complementação do BCG com proteínas exógenas de interesse na superfície de bactérias, ao invés de transformação com plasmídeos codificação de genes correspondentes. Primeiro, as proteínas de interesse são expressos em fusão com avidin monomérico em padrão Escherichia coli sistemas de expressão e, em seguida, usado para decorar a superfície de biotinilado BCG. Usando a superfície de BCG decorado com antígeno de ovalbumina substituto das experiências com animais demonstram que a bactéria modificada é totalmente imunogênicas e capazes de induzir respostas de célula T específica. No total, os dados aqui apresentados fortemente apoiar um romance e um método eficiente para remodelar a vacina BCG atual que substitui a abordagem convencional laboriosa de complementação com os ácidos nucleicos exógenos.

Introduction

Várias estratégias têm sido propostas para substituir a atual vacina contra tuberculose BCG, incluindo sistemas de adjuvante da proteína, tecnologias em vetor virais, M.tb cepas atenuadas e cepas de BCG geneticamente modificadas, também para introduzir genes excesso, expressando antígenos de BCG que não são suficientemente expressa durante infecção1 ou Mtb-antígenos específicos, não presentes na BCG2. Engenharia genética, no entanto, enfrenta muitos obstáculos, incluindo o nível incerto de segurança, o processo demorado e a baixa eficiência de expressão vetores4,5. Com relação à melhoria da BCG, uma abordagem alternativa é necessário para melhorar a imunogenicidade sem a necessidade de alternações genéticas incertas.

Neste estudo, apresentamos uma estratégia romance para exibição de proteínas recombinantes de interesse na superfície das células de BCG que baseia-se na interação conhecida avidin alta afinidade com biotina. Esta abordagem permite fixação rápida e reprodutível de proteínas recombinantes avidin da fusão na superfície do biotinilado BCG, o que facilita o amplas manipulações de BCG para alcançar a máxima melhoria da sua eficácia, mantendo sua segurança excelente grave, observada ao longo de décadas de uso.

Afinidade avidina biotina é extremamente alta (Kd = 10−15 M) e uma vez formado, o complexo biotina-avidina é muito estável e pode ser interrompido somente sob condições6de desnaturação. No entanto, para este tipo de interação para servir como uma alternativa de método de transferência genética, exposição a longo prazo mas reversível das proteínas recombinantes é necessária. Assim, apresentamos aqui uma avidina monomérica de baixa afinidade (Kd = 10−7 M) que leva à liberação reversível de proteína da superfície decorada BCG, uma vez ingerido dentro de células apresentadoras. A fim de fornecer uma prova de conceito, nós testamos esse método usando uma proteína quimérico avidin monomérico, correspondente a um antígeno substituto derivado de ovalbumina (OVA)7,8. Os resultados mostraram que a superfície da célula BCG pode ser facilmente e rapidamente decorada com proteínas da fusão avidin monoméricos e que essa ligação à superfície de BCG é estável e pode ser reproduzido sem alterações detectáveis no crescimento bacteriano e sobrevivência. Além disso, encontramos que a BCG decorado com avidin monomérico fundida com óvulos (AviOVA) pode induzir uma resposta imune semelhante àquela induzida por BCG geneticamente expressando o mesmo antígeno tanto in vitro e in vivo. Esta tecnologia de display reversível das proteínas de interesse na superfície bacteriana é, portanto, um substituto eficaz das abordagens de transferência do gene tradicional e pode fornecer uma plataforma para grandes manipulações de BCG e outras aplicações em vacina desenvolvimento.

Protocol

Todos os animais foram mantidos em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado Animal e comissões de utilização na Universidade da Colúmbia Britânica. Experimentos foram aprovados pelos comitês de uso e cuidado Animal e executados de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal. O número de bem-estar animal garantia é A11-0247. 1. geração de proteínas da fusão Avidin monomérico expressando plasmídeos Clone sub avidin monomérico seq…

Representative Results

Com os procedimentos gerais descritos acima, foi examinada a viabilidade da superfície biotinylation BCG e decoração com substituto do antígeno óvulos. A imunogenicidade do BCG modificado foi então testado em vivo. A superfície bacteriana foi facilmente rotulada com biotina para exibição rápida dos antígenos quimérico de avidina sem qualquer alteração detectável em fenótipos bacterianas. A BCG modificada resultante é eficientemente ingerido pelas células de apre…

Discussion

Nós relatamos neste estudo uma abordagem não-genético para exibição rápida e eficaz de proteínas exógenas na superfície de BCG para adicionar propriedades funcionais específicas eficientemente melhore imunogenicidade da bactéria ou antígenos específicos. Demonstrámos que superfície celular BCG pode ser facilmente biotinilado para decoração de superfície instantânea com proteínas da fusão avidina. O procedimento total pode ser realizado até 2 horas, enquanto transformação genética e seleção de c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. R Stokes para a cepa BCG Pasteur e r. Talal para suporte técnico. Agradecemos também o GenScript para obter ajuda com a síntese do gene.

Materials

Endotoxin-free RPMI 1640 StemCell Technologies  36750
Sulfo-NHS SS biotin Thermo Fisher  21328
FITC-conjugated streptavidin Sigma-Aldrich S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer  MBL International  TS-M710-1
7-AAD  BD Pharmingen 559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin  Clontech 635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g BD Bioscience  557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E BD Bioscience  562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab BD Bioscience  561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb  BD Bioscience  562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody Thermo Fisher 31635
AF 647 rat anti-mouse CD4 BD Bioscience  557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG  Electron Microscopy Sciences  25100
Middlebrook 7H9 broth  BD Diagnostic Systems 271310
OADC BD Diagnostic Systems B11886
Tween 80 Sigma-Aldrich P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines  American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid  Invitrogen 11803012
pUC57-OVA plasmid  GenScript SD1176
BP clonase  Invitrogen 11789020
LR clonase  Invitrogen 11791043
pDONR221 plasmid Invitrogen 12536017
Ni-NTA columns  Qiagen 31014
Pierce protein concentrators  Thermo Fisher  88527
Flurosave Calbiochem-Novabiochem 345789
Axioplan II epifluorescence microscope Carl Zeiss Inc
CCD digital camera  Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope  FEI Company G2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer  Thermo Fisher  87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit  StemCell 18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody BioLegend 116203
Brefeldin A BD Pharmingen 555029
Cytofix/Cytoperm kit  BD Pharmingen 554714
Bright-Glo Luciferase assay system Promega e2620
Turner Biosystem luminometer  Promega TD-20/20
Leica EM UC6 microtome  Leica Microsystems UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer Savant Instruments  NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials Wheaton  VWR 66011-675

References

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

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Liao, T. A., Lau, A., Sunil, J., Hytönen, V., Hmama, Z. Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (131), e56421, doi:10.3791/56421 (2018).

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